微波辅助提取金花葵多糖工艺及体外抗氧化性研究

陈冯钱，黄杰涛，郑婷婷，张莲姬

（延边大学理学院，吉林延吉133000）

微波辅助提取金花葵多糖工艺及体外抗氧化性研究

陈冯钱，黄杰涛，郑婷婷，张莲姬*

（延边大学理学院，吉林延吉133000）

以多糖得率为指标，采用正交设计法优化微波辅助提取金花葵多糖的工艺，并测定金花葵多糖的体外抗氧化活性。结果表明：微波辅助提取金花葵多糖的最佳工艺条件为微波功率280 W、微波辐射时间2 min、提取温度70℃、提取时间3.0 h，在此条件下多糖平均得率为5.51%；金花葵多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基具有明显的清除能力，并能够有效抑制小鼠肝匀浆脂质的过氧化，其IC50分别为0.068、1.23、1.20 mg/mL。

金花葵；多糖；微波辅助提取；抗氧化

Abstract：Based on polysaccharide yield indicators，the optimum processing conditions of microwave-assisted extraction of polysaccharides fromAurea helianthustemswere studied by orthogonal design method，and determined the antioxidant activity ofAurea helianthustemspolysaccharide.The results indicated that the optimum extraction parameters of polysaccharide were microwave power 280 W，microwave radiation time 2 min，hydrothermal extraction temperature 70℃，hydrothermal extraction time 3.0 h.Under the optimum conditions，the average extraction rate of polysaccharide was 5.51%.Aurea helianthustemspolysaccharide had the effective scavenging activities of hydroxyl radical and superoxide anion free radical.In addition，it could inhibit the peroxidation of the mouse liver homogenate.The IC50was 0.068，1.23，1.20 mg/mL，respectively.

Key words：Aurea helianthustems；polysaccharides；microwave-assisted extraction；antioxidant

金花葵（Aurea helianthustems）为锦葵科、秋葵属1年生草本植物，在200多种秋葵属植物中最具食用、药用、保健价值的植物。目前野生金花葵濒临绝种，但在太行山东部山麓地区及晋中、晋南地区、东北地区有很多金花葵人工种植基地，其资源很丰富[1]。金花葵的花、茎、叶、种子中都含有丰富的生物活性物质，如黄酮[2-3]、金丝桃苷[4]、不饱和脂肪酸[5]、微量元素[6]、挥发油[7]、多糖等[8]。

多糖在自然界分布极广，亦很重要。有的是构成动植物细胞壁的组成成分，有的是作为动植物储藏的养分。近年来对多糖的研究不断深入，发现其具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、降血糖、抗辐射、调节免疫等[9]多种生物活性。目前，对金花葵的研究多数集中在栽培、黄酮、不饱和脂肪酸等方面，而对金花葵多糖的研究鲜有报道[10]。

微波辅助法作为一种新型技术，广泛应用于天然活性成分的提取，它具有穿透性强、能耗小、时间短、得率高等优点[11]，而目前对金花葵中多糖的微波辅助提取和抗氧化活性的研究报道较少。本文以金花葵的茎叶粉为材料，以多糖得率为指标，通过正交试验优化微波辅助提取金花葵多糖的提取工艺，并对所提取的多糖从清除羟基自由基、清除超氧阴离子自由基和抑制小鼠肝匀浆脂质的过氧化等3个方面进行了抗氧化活性研究，以期为进一步开发金花葵资源提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金花葵茎叶粉：金花葵茎叶由吉林省延吉市人工种植基地提供，实验室烘干，粉碎，过60目筛，装入密封袋备用；小鼠：雄性，体重18 g～20 g，由延边大学医学部提供。

T6新世纪紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；80-2台式离心机：金坛市科析仪器有限公司；LGWD700（MG-5012M）微波炉：乐金电子（天津）电器有限公司。

石油醚、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、邻二氮菲、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、邻苯三酚、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（分析纯）：国药集团药业股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金花葵多糖的提取工艺流程及得率计算

金花葵茎叶于60℃低温烘干至恒质量后粉碎过60目筛子→用石油醚和无水乙醇索氏抽提脱脂处理后60℃恒温烘干→微波辅助水浸提取金花葵茎叶粉→离心→浓缩上清液→醇沉→离心→金花葵粗多糖→sevag法除蛋白[12]→活性炭脱色[13]→60℃恒温烘干→金花葵多糖

金花葵多糖含量的测定及得率的计算：采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖为标准品制作标准曲线，得到的线性回归方程为y=0.010 5x-0.062 2，R2=0.997 4，参照文献[14]测定其换算因子为1.093。按公式（1）计算多糖含量。

式中：C为测得的样品溶液中葡萄糖浓度，μg/mL；D为样品溶液稀释倍数；f为换算因子；W为金花葵茎叶粉质量，g。

1.2.2 单因素及正交试验设计

依次选择微波功率、提取温度、提取时间、微波辐射时间，设计不同水平，进行单因素试验，试验中料液比均为1∶30（g/mL），提取次数均为2次。每个单因素试验做出的最优值作为下一组单因素的固定条件值。

微波功率的选择为提取时间2 h，微波时间1 min，提取温度 60 ℃，分别在 140、280、420、560、700 W 微波功率下提取多糖。

提取温度的选择为提取时间2 h，微波功率280 W，微波时间 1 min，分别在 40、50、60、70、80、90 ℃浸提条件下提取多糖；

提取时间的选择为提取温度70℃，微波功率280 W，微波辐射时间 1 min，分别在 1、1.5、2、2.5、3、3.5 h浸提时间下提取多糖；

微波辐射时间的选择为提取温度70℃，微波功率 280 W ，提取时间 3 h，分别在 1、2、4、6、8、10 min 的微波辐射时间条件下提取多糖。

根据单因素试验结果，设计进行L9（34）正交试验，因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 金花葵多糖体外抗氧化活性

羟基自由基清除率，参照H2O2/Fe体系法测定[15]，超氧阴离子自由基清除率，采用邻苯三酚自氧化法测定[16]，对小鼠肝匀浆脂质过氧化抑制率，采用TBARS法测定[17]，并分别计算出IC50（清除率达到50%时反应物的浓度）。

2 结果与分析

2.1 提取金花葵多糖的单因素试验

微波功率、提取温度、提取时间、微波辐射时间对金花葵多糖提取效果的影响如图1、图2、图3、图4所示。

图1 微波功率对多糖得率的影响Fig.1 Effect of microwave power on polysaccharides extraction rate

图2 提取温度对多糖得率的影响Fig.2 Effect of temperature on polysaccharides extraction rate

图3 提取时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction times on polysaccharides extraction rate

图4 微波辐射时间对多糖得率的影响Fig.4 Effect of microwave radiation time on polysaccharides extraction rate

微波功率 140、280、420、560、700 W 条件下的金花葵多糖得率分别为2.8%、3.27%、2.98%、2.73%、2.51%，可见随着微波功率的提高，得率先增加，后缓慢下降，280 W时得率最大。因此选择280 W为最佳的微波功率。

提取温度 40、50、60、70、80、90 ℃条件下的金花葵多糖得率分别为2.29%、2.87%、3.16%、4.95%、3.36%、3.05%，可见提取温度为40℃～70℃范围内，随着温度的升高，多糖得率也相应的增加，在70℃时达到最大值，之后随着温度的增加，多糖得率开始下降。探究其可能的原因是当温度较低时，不能够充分提取出多糖，但温度过高的时候，导致多糖的分解，其得率从而下降，因此选择最佳的提取温度为70℃。

提取时间 1、1.5、2、2.5、3、3.5 h 条件下的金花葵多糖得率分别为 3.21%、3.61%、3.82%、4.21%、5.08%、4.87%，可见提取时间1 h～3 h范围内，金花葵多糖得率随提取时间的增加而升高，但超过3 h，得率反而开始下降，因此选择最佳的提取时间为3.0 h。

微波辐射时间 1、2、4、6、8、10 min 条件下的金花葵得率分别为 5.04%、5.46%、5.25%、4.96%、4.62%、4.53%，可见微波时间为2 min时，得率最高。辐射时间2 min之后，随着时间的增加，多糖的得率缓慢下降，这是由于开始时微波辐射时间的增加有助于多糖的溶出，但当时间过长可能会导致多糖结构受到破坏[18]，因此选择最佳的微波辐射处理时间为2 min。

2.2 提取金花葵多糖的正交试验

正交试验设计与数据处理见表3。

表3 正交试验设计与数据处理表Table 3 The design and results of orthogonal test

由表3可知，各因素对金花葵多糖得率的主次因素为微波功率＞提取温度＞微波辐射时间＞提取时间。从正交试验结果分析而知，最佳提取组合为A2B2C2D2，而由表3可以看出，最佳提取组合为A2B2C3D1。因此对这两个组合进行对比试验，其结果见表4。

表4 试验组的多糖得率结果Table 4 The result of polysaccharide sample’s experience%

由表4可知，A2B2C2D2组合优于A2B2C3D1组合，因此微波辅助提取金花葵多糖的最佳工艺条件是微波功率为280 W，微波辐射时间为2 min，提取温度为70℃，提取时间为3.0 h。

2.3 金花葵多糖抗氧化性的测定

金花葵多糖的浓度对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率的影响及对小鼠肝匀浆脂质过氧化的影响如图5、图6、图7所示。

图5 金花葵多糖浓度对羟基自由基清除率的影响Fig.5 Effects ofAurea helianthustemspolysaccharide concentration on clearance ratio of hydroxyl free radical

图6 金花葵多糖浓度对超氧阴离子清除率的影响Fig.6 Effects ofAurea helianthustemspolysaccharide concentration on superoxide anion radical

图7 金花葵多糖浓度对肝组织脂质过氧化的影响Fig.7 Effects ofAurea helianthustemspolysaccharide concentration on lipid peroxide of liver homogenate

由图5、图6、图7可知，在试验浓度范围内，金花葵多糖对自由基的清除率及脂质过氧化抑制率的影响是相同的，都随金花葵浓度的增加而提高。金花葵多糖对两种不同自由基的清除效果有显著的区别，清除羟基自由基的IC50为0.068 mg/mL，而清除超氧阴离子自由基的IC50为1.23 mg/mL，浓度相差近18倍，说明金花葵多糖对羟基自由基具有更好清除作用。金花葵多糖抑制小鼠肝组织脂质过氧化的IC50为1.20 mg/mL，当金花葵多糖的浓度为2.5 mg/mL时，其抑制率达80.2%，表明金花葵多糖能够显著抑制小鼠肝脂质过氧化的发生。

3 结论

1）本研究经单因素与正交试验优化微波辅助提取金花葵多糖的工艺条件，即微波功为率280 W，微波辐射时间为2 min，提取温度为70℃，提取时间为3.0 h。在最优提取工艺条件下，金花葵多糖平均得率为5.51%，试验的4种因素对金花葵多糖得率的影响作用大小顺序依次为微波功率＞提取温度＞微波辐射时间＞提取时间。

2）在体外抗氧化试验中金花葵多糖表现出较强的抗氧化能力，金花葵多糖清除羟基自由基、超氧阴离子自由基的能力和对小鼠肝脂质过氧化抑制能力均与其浓度呈正相关关系，对羟基自由基的清除能力大于超氧阴离子自由基的清除能力。

[1]卢丹,贾瑞波.中药金花葵的研究进展[J].中国药物评价,2015,32(2):90-92

[2]兰蓉,李浡,刘卉,等.金花葵总黄酮的提取和含量测定[J].江苏农业科学,2012,40(12):280-282

[3]危晴,兰蓉,辛秀兰,等.紫外分光光度法测定金花葵籽中总黄酮的含量[J].安徽农业科学,2012,40(12):7050-7060

[4]邱金玲,刘朋,熊维政,等.金花葵中金丝桃苷的含量测定[J].中医学报,2015,30(12):1793－1795

[5]李浡,胡定煜,李双石,等．金花葵油中不饱和脂肪酸的GC-MS测定[J]．食品研究与开发,2012,33(5):121-123

[6]刘临.原子吸收光谱法测定金花葵中微量元素[J].微量元素与健康研究,2008,25(4):27-29

[7]王刚,郭延磊.金花葵子挥发油的化学成分分析[J].安徽农业科学,2010,38(14):7297－7298

[8]程丽敏,董爽,梁文明,等.金花葵茎可溶性糖的提取及抗氧化性研究[J].食品研究与开发,2016,37(22):59-63

[9]申利红,王建森,李雅,等.植物多糖的研究及应用进展[J].中国农学通报2011,27(2):349-352

[10]黄杰涛,张莲姬.响应面法优化金花葵多糖提取工艺[J].食品工业科技,2016,37(19):217-220

[11]张晓静,龚婷,扶庆权,等.响应面法优化微波辅助提取苹果皮中总黄酮的工艺研究.甘肃农业大学学报,2015,50(6):148-155

[12]赵燕珠,吴周和,柯百胜,等.啤酒酵母多糖脱蛋白方法的应用研究[J].食品工业科技,2009,30(10):244-249

[13]张丽红,谢三都,徐芳,等.紫苏叶多糖活性炭脱色工艺优化[J].食品与机械,31(3):224-230

[14]张霞,聂少平,李景恩,等.夏枯草中多糖的提取与含量的测定[J].食品研究与开发2012,33(12):81-85

[15]金鸣,蔡亚欣,李金荣,等.邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe体系产生的羟自由基[J].生物化学与生物物理进展,1996,23(6):553-555

[16]王威,左双海,程超.贡水白柚柚皮乙醇提取物的体外抗氧化作用[J]．食品科学,2010,15(31):143-148

[17]王新伟,崔言开,田双起,等.牛至油、香芹酚、柠檬醛和肉桂醛的抗氧化性能研究[J]．食品工业科技,2013,34(14):311-314

[18]许丽丽,沈楚椰.溪黄草多糖的微波提取及其抗氧化性研究[J].食品研究与发,2016,36(19):64-67

Microwave-assisted Extraction and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Aurea helianthustems Polysaccharide

CHEN Feng-qian，HUANG Jie-tao，ZHENG Ting-ting，ZHANG Lian-ji*
（College of Science，Yanbian University，Yanji 133000，Jilin，China）

2017-02-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.011

延边大学2016年大学生创新创业训练计划项目（ydbksky2016101）

陈冯钱（1996—），男（汉），本科在读，研究方向：天然产物提取及活性研究。

*通信作者：张莲姬，副教授，博士，研究方向：天然产物提取及活性研究。