宁夏地区奶牛新孢子虫病的流行病学调查

康晓冬高海慧脱征军邵怀峰张和平马振明孙文华温 万*

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.宁夏畜牧工作站，宁夏银川 750002；3.宁夏动物疫病控制预防中心，宁夏银川 750002；4.宁夏石嘴山市惠农区畜牧水产技术服务中心 宁夏石嘴山 753200；5.宁夏吴忠市利通区畜牧水产技术服务中心，宁夏吴忠 751100）

宁夏地区奶牛新孢子虫病的流行病学调查

康晓冬1高海慧1脱征军2邵怀峰2张和平3马振明4孙文华5温 万2*

（1.宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏银川 750002；2.宁夏畜牧工作站，宁夏银川 750002；3.宁夏动物疫病控制预防中心，宁夏银川 750002；4.宁夏石嘴山市惠农区畜牧水产技术服务中心 宁夏石嘴山 753200；5.宁夏吴忠市利通区畜牧水产技术服务中心，宁夏吴忠 751100）

为了解宁夏地区奶牛新孢子虫病的发生情况，于2016年6月～9月对宁夏奶牛核心养殖区具有代表性的9个奶牛养殖场按照5%的比例随机采血1796份，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测奶牛新孢子虫病血清抗体。结果显示，9个养殖场均有新孢子虫血清阳性牛存在，场血清阳性率为100%；各场奶牛检测阳性率在7.58%～30.77%，平均血清阳性率24.11%；表明该病在宁夏奶牛养殖牧场中存在，但感染处在一个中等略低的水平。

宁夏 奶牛 新孢子虫 流行病学调查

新孢子虫病是由犬新孢子虫寄生在犬、牛等多种动物体内的一种细胞内寄生的原生动物寄生虫病[1]。可以引起牛、绵羊、山羊和马流产或产死胎、木乃伊胎，以及新生幼畜发病和死亡。该病可通过胎盘垂直传播，对牛养殖业的危害最为严重。新孢子虫宿主范围较广，促进了该病的传播感染。该病最早发现于1984年[2]，呈世界性分布。我国对该病研究起步比较晚，2003年，刘群教授等[3]首次报道了该病在我国奶牛中存在。现在已有70多个国家报道了该病的存在发生，给畜牧养殖业带来巨大的经济损失，严重影响养殖业的健康发展。为了明确该病在宁夏奶牛养殖中的存在和分布流行情况，宁夏回族自治区奶牛产业技术服务团队于2016年6月～9月，对本区奶牛新孢子虫病开展了流行病学调查，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 被检血清 遴选宁夏地区奶牛核心养殖区具有代表性的9个奶牛养殖场（牧场、养殖园区等）按照5%的比例随机采血1796份，室温下静置2～3h后，在4℃ 3000r/min离心5min，析出血清-20℃保存备检。

1.1.2 检测试剂 犬新孢子虫抗体检测试剂盒：美国爱得士生物科技公司（IDEXX）生产。

1.1.3 主要检测仪器设备

（1）台式高速冷冻离心机（H-1850R 长沙湘仪离心机有限公司）；

（2）酶标仪（iMark 美国BIO-RAD公司）；

（3）全自动洗板机（RT-3000 深圳雷杜生命科学股份有限公司）；

（4）微量移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

（1）样品的准备：用样品稀释液对检测样品做100倍（1：100）稀释，不稀释对照样，每个样品更换吸头。样品在加入犬新孢子虫包被板之前混匀。所有试剂在使用之前恢复至18℃～26℃，试剂通过轻柔地颠倒或震荡混匀。

（2）洗涤溶液的制备：浓缩洗涤液（10×）应置于18℃～26℃并混匀以确保沉淀的盐溶解。使用之前浓缩洗涤液（10×）用去离子水进行10倍稀释。

（3）取出抗原包被板，记录每个样品在反应板上的位置。

（4）加入100μl未稀释的阴性对照，每次检测加两个孔。

（5）加入100μl未稀释的阳性对照，每次检测加两个孔。

（6）在剩下的孔中加入100μl稀释好的样品。

（7）在18℃～26℃的条件下孵育30min（±2min）。

那天她回去后，就病了。心理的脆弱让她的身体不堪一击。她发烧，总是很冷。窝在床角发呆。她想他。她想如果这时他能来一个电话，或者一条短信，她就原谅他了。原谅他对自己的不认真，也原谅自己在这场关系中的失败。她会一直和他那样下去，即使只是性伙伴。

（8）弃去所有孔中液体。

（9）每孔加入300μl洗涤溶液，洗涤4 次。每次洗完弃掉所有孔中液体成分。在两次洗涤之间以及加入酶标记抗体之前避免反应板干燥。在最后一次洗涤之后吸掉液体，轻柔并彻底地在吸水材料上拍干每块反应板。

（10）每孔加入100μl酶标抗体。

（11）在18℃～26℃的条件下孵育30min（±2min）。

（12）重复步骤（8）和（9）。

（13）每孔加入100μlTMB 底物溶液。

（14）在18℃～26℃的条件下孵育15min（±1min）。

（15）每孔加入100μl终止液来终止反应。

（16）在620～650nm下读数并记录吸光值。

（17）计算结果 结果判定按照诊断试剂盒结果判定要求进行。

2 结果与分析

9个奶牛场的1796份血清中共检出犬新孢子虫抗体阳性血样433份，平均血清阳性率为24.11%，在9个被检牛场中均有犬新孢子虫血清阳性牛存在，场感染阳性率为100%，其中最高血清阳性率为30.77%，最低为7.58%，结果详见表1。

表1 宁夏地区奶牛犬新孢子虫血清抗体检测结果

3 小结与讨论

3.1 检测方法

（1）ELISA法与病原学检测方法相比较，具有检测快速、简便易行、灵敏度高、人为主观因素影响小的特点，既可行又可靠，是目前新孢子虫病检测最常用的方法之一，可用于大批量样本的检测。

（2）ELISA法是根据抗原抗体特异结合的原理建立的，新孢子虫每个时期所表达的抗原蛋白不一样，所以，血清学方法不能检测到新孢子虫的所有生活史阶段，尤其是终末宿主阶段[4]。

3.2 宁夏奶牛新孢子虫病血清学检验结果

通过对宁夏奶牛进行的新孢子虫流行病学调查结果显示，结果显示9个养殖场均有犬新孢子虫血清阳性牛存在，场血清阳性率为100%；各场奶牛检测阳性率在7.58%～30.77%，平均血清阳性率24.11%；表明该病在宁夏奶牛养殖牧场中存在，但感染率处在一个中等略低的水平。但因其对奶产业健康发展的巨大危害，还是应引起主管部门及奶牛养殖场的高度重视，并要制定一系列防控措施，控制该病在奶牛中的传播。

3.3 奶牛新孢子虫病防控

（1）加强饲养管理：规范奶牛场饲养管理，科学调配饲料，增强奶牛体质，提高奶牛抗病性，减少该病的感染。

（2）加强检疫：引进牛只一定要进行检疫，避免将患牛引入牛场。

（3）目前还没有研制出治疗新孢子虫病的特效药物和疫苗，防治的有效办法是通过检测后确定阳性感染的牛做淘汰处理，建立无新孢子虫感染牛群。

[1]Lindsay DS，Dubey JP. Confirmation that the dog is a definitive host for Neospora caninum [J].Vet Parasitol，1999，82（4）：327-333.

[2]Bjerkas I，Mohn SF，and Presthus J.Unidentified cyst-forming sporozoon causing encephalomyelitis and myositis in dogs[J].Z Parasitenkd，1984，（70）：271-274.

[3]刘群，李博，齐长明，等.乳牛新孢子虫病检测初报[J].中国兽医杂志，2003，39（2）：8-9.

[4]杜玲.长春地区新孢子虫病流行病学调查[D].吉林大学，2014.

宁夏回族自治区“2016年20项农业重大实用推广项目-奶牛繁殖障碍综合防控技术的示范与推广”。

康晓冬（1971-），男，宁夏中宁人，研究员，主要从事牛羊反刍家畜的疫病防治研究工作。

温 万