不同测定因素对凯氏定氮法粗蛋白测定的影响

杨文华

（内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽 028000）

不同测定因素对凯氏定氮法粗蛋白测定的影响

杨文华

（内蒙古民族大学动物科学技术学院，内蒙古通辽 028000）

本试验依据凯氏定氮法测定粗蛋白含量的步骤，研究了不同消化温度、消化时间、催化剂用量、硼酸吸收液是否加减、蒸馏时间以及盐酸浓度等对饲料中粗蛋白含量测定值的影响。

测定因素 凯氏定氮法 粗蛋白

蛋白质是饲料中含氮化合物的总称，是支持生命活动的先决条件，更是构成生命体细胞和抗体等不可或缺的关键成分[1]。饲料中蛋白质含量的高低直接影响到动物个体生长和新陈代谢速度，因而，准确测定饲料中的蛋白质含量显得尤为重要[2]。

粗蛋白质的测定方法很多，包括凯氏定氮法、过氧化氢测定法、国标法和双缩脲法等[3]。由于凯氏定氮法测定简单，试剂和试验条件容易获得，因而在实际中使用最多、应用范围最广。诸多实践证明，凯氏定氮法较适用于单一饲料粗蛋白、浓缩饲料粗蛋白等测定。凯氏定氮法的原理是用浓硫酸对试样进行消化，使试样中的蛋白质等含氮物的氮素转化为氨[4]，被硫酸吸收生成硫酸铵，其后加入碱液进行蒸馏，当氨逸出后用硼酸予以吸收，最后用酸标准溶液完成滴定得到含氮量进行粗蛋白质换算。由于测定时涉及消化、吸收、蒸馏和滴定等众多环节，因而凯氏定氮法的影响因素相应较多，如消化温度、消化时间、催化剂、蒸馏时间、盐酸浓度等。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选用进口鱼粉、玉米秸秆和大豆粕为试验材料，试样粉碎并通过0.45mm分样筛，分别混合均匀后置于密封容器中保存待用。试剂按照《GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法》[5]准备。粗蛋白测定仪器为KDN-08凯氏定氮仪。

1.2 试验方法

试验采用单因子试验设计，分别研究不同消化温度、消化时间、催化剂用量、硼酸吸收液加碱量、蒸馏时间、盐酸浓度对凯氏定氮测定结果的影响。

1.2.1 消化温度的影响试验 试验过程中选用材料为大豆粕。将消化温度设为380 ℃、400 ℃、420 ℃、440 ℃、460 ℃共5个处理，使用凯氏定氮法对样品进行消化蒸馏滴定，比较在不同消化温度条件下的测量结果。

1.2.2 消化时间的影响试验 试验过程中选用材料为大豆粕。将消化时间设为30min、60min、120min、180min、240min、300min共6个处理，使用凯氏定氮法对样品进行消化蒸馏滴定，比较在不同消化时间条件下的测量结果。

1.2.3 不同催化剂用量的影响试验 选用大豆粕为试验样品，选用硫酸铜和硫酸钾两种混合催化剂进行对比试验，其比例为1：15，催化剂用量设为3.4 g、4.4 g、5.4 g、6.4 g、7.4 g共5个处理，使用凯氏定氮法对样品进行消化蒸馏滴定，比较在不同催化剂用量条件下的测量结果。

1.2.4 硼酸吸收液加碱的影响试验 在试验过程中参照《GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法》[5]中硼酸的配置方法，同时设置2个处理，分别在1000 ml硼酸吸收液中加入0.5 ml 4%氢氧化钠和不加氢氧化钠。每个处理测定3个平行。

1.2.5 蒸馏时间的影响试验 选用大豆粕为试验样品，试验过程中将蒸馏时间设为3min、4min、5min、6min、7 min共5个处理，依据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.2.6 盐酸浓度的影响试验 试验过程中分别选用鱼粉、大豆粕、玉米秸秆为试验样品，每个试验样品的盐酸浓度依次设为0.10、0.05、0.01 mol/L共3个处理，依据凯氏定氮法进行消化蒸馏滴定。

1.3 数据处理

试验采用单因子完全随机化设计，数据采用SAS8.1统计软件中的广义线性模型（GLM）进行方差分析和多重比较（SNK）。

2 结果

2.1 消化温度的影响

试验结果表明，在380℃和400℃的消化管中的溶液为不透明的黑色，意味着其未能完全消化，其他温度下消化试管中均为蓝色透明。各处理的凯氏定氮法测定结果见图1，图1表明，消化温度为420℃时所测得的粗蛋白相对含量高于其他处理，测定结果更准确。

图1 不同消化温度对凯氏定氮测定结果的影响

2.2 消化时间的影响

试验结果表明，30min消化后的样品为黑色，而60min消化的样品为淡蓝色，其他消化时间的样品颜色均为蓝色透明。各处理的凯氏定氮法测定结果见图2，当样品消化时间为30min时，其蛋白质含量偏低，随着消化时间的逐渐增加，蛋白质测定值逐渐提高。当其消化时间为2h时，到达临界点增长速度放缓，甚至和消化5h后的蛋白质含量无明显差异，由此可以得出结论，消化时间控制在2h时最为适中。

图2 不同消化温度对凯氏定氮测定结果的影响

2.3 催化剂用量的影响

试验结果表明，当催化剂用量为3.4g和4.4g时，消化后试验样品颜色为黑色。当催化剂用量为6.4g时，消化后试验样品为蓝色透明，当催化剂用量为7.4g时，试验组消化管内存有黑色物体。

图3 不同催化剂用量对凯氏定氮测定结果的影响

2.4 硼酸吸收液加碱的影响

试验结果表明，硼酸吸收液加碱与否对试验结果有直接影响。从表1中可知，硼酸加碱所测得的空白值大于不加碱的处理，但对样品粗蛋白的测定结果的影响极小，可以忽略不计。

表1 硼酸吸收液加碱对粗蛋白相对含量测定结果的影响

2.5 蒸馏时间的影响

试验结果见图4，由图可知，当蒸馏时间在5～7min时，粗蛋白测定值较为接近，可认为试验消化管中存有的游离氨可被全部蒸馏出来，被硼酸完全吸收；当蒸馏时间为3～4min时，粗蛋白测定值偏低，可认为消化管内游离氨未蒸发完全；表明当蒸馏时间控制在5min时，消化管内的游离氨完全蒸发。

图4 不同蒸馏时间对凯氏定氮测定结果的影响

2.6 盐酸浓度的影响

试验结果如表2所示。试验结果表明，在鱼粉粗蛋白的测定中，盐酸的浓度越低，试验测定差异就越大。在豆粕粗蛋白的测定中，盐酸的浓度越低，试验测定差异就越大。而玉米秸秆粗蛋白的测定中，盐酸浓度越高，测定误差越大。

表2 不同样品盐酸滴定的平均消耗用量，ml

3 讨论

3.1 消化温度的影响

凯氏定氮法测定粗蛋白过程中，消化温度会直接影响样品的消化速度，一般要求控制消化温度不使消化速度过快，刚开始时以小火为宜，等到样品焦化后再提高温度。必要时可以晃动瓶身消除因消化而产生的泡沫，避免消化不完全。研究发现，当消化温度低于420℃时，数据结果偏小。但若温度升温过快，部分含氨物质无法在规定时间内转化为硫酸铵，甚至是以气体形式损失掉，则容易造成测定结果偏低。《GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法》[5]中规定消化温度为360℃～410℃，但实际消化时可针对实际情况进行适当调整，当然消化温度一般不超过450℃，否则造成蛋白质分解，影响试验结果准确性[6]。

3.2 消化时间的影响

凯氏定氮法测定粗蛋白的消化时间比较容易控制，根据本试验结果，样品消化时间大于2h，即可消化完全。若消化时间超过2h，粗蛋白质含量不仅不会增加，反而降低，因此建议将消化时间控制在2h为宜。

3.3 催化剂用量的影响

试验表明，当催化剂用量为6.4g时消化最为彻底，所获取数据也最为准确。催化剂用量要求适宜，过少会致使消化不完全，过多则会留有难以消化的黑色物体，两者都会对测定结果产生不利影响。

3.4 硼酸吸收液加碱的影响

就粗蛋白测定结果总体而言，硼酸对于粗蛋白测定结果产生的影响较小，很大程度上是因为硼酸吸收液的酸碱度对饲料样品和对空白对照组的作用是相同的，这样便可将这一影响消除。硼酸加碱的意义在于，加碱之后进行滴定试验，所观察到的颜色反应更加明显，有利于试验者进行滴定终点的判断。

3.5 蒸馏时间的影响

尽管蒸馏时间为5min时，消化管内游离氨均可完全蒸发。但随着蒸馏时间的延长，锥形瓶中的溶液体积逐渐加大，当蒸馏时间超过7min时，蒸馏液将超过试验锥形瓶的三分之二，体积过大将影响后续滴定试验。因而，以控制蒸馏时间为5min为宜。

3.6 盐酸浓度的影响

经过试验研究发现：当盐酸在滴定量小于5ml或者大于40ml时，所造成的滴定误差相对较大。因此，盐酸的浓度选择需要参照试样大体的粗蛋白含量进行选择，若蛋白质含量较高时，应当选用高浓度盐酸予以滴定，反之亦然，这样能够保证测定结果的准确性[7]。

4 结论

实验结果显示，用凯氏定氮法测定粗蛋白时，消化温度以420℃效果最好，消化时间最好控制在2h，催化剂用量以6.4g为宜，硼酸吸收液是否加碱对测定结果影响比较小，蒸馏时间在5min为宜，粗蛋白的大体含量则为盐酸浓度的主要决定因素。总体而言，消化温度、消化时间和催化剂用量为影响消化结果的主要因素。

[1]丁进海.饲料中粗蛋白测定的影响因素分析[J].现代农业科技，2015，（17）：302-304.

[2]刘新国.饲料蛋白质分析探讨[J].江西饲料，2002，（6）：23-24.

[3]张峻炎，杨策，田亚平，等.啤酒泡沫蛋白质的初步分离及测定[J].酿酒，2002，（5）：66-67.

[4]曲玲，汪海棠，徐学博，等.食品中蛋白质测定方法的研究[J].中国新技术新产品，2015，（6）：68.

[5]饲料中粗蛋白测定方法：GB/T6432-1994[S].北京：中国标准出版社，1994.

[6]杜增鹏.海参活性肽口服液蛋白含量检测技术研究[J].食品安全导刊，2015，（12）：63-64.

[7]屈健.非水溶液滴定法的影响因素分析[J].中国兽药杂志，2002，（10）：42-43.