色谱手性分离研究

李克丽，袁黎明，章俊辉，李宏宁，谢生明，谌学先，伍 鹏， 吴玉萍，朱鹏静，段爱红，艾 萍

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

专论(159～164)

色谱手性分离研究

李克丽，袁黎明，章俊辉，李宏宁，谢生明，谌学先，伍 鹏， 吴玉萍，朱鹏静，段爱红，艾 萍

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

手性是自然界的基本属性之一，不同的手性单体具有不同的生理活性，将手性化合物有效的分离具有十分重要的意义. 色谱法和膜分离法在拆分手性化合物中得到了越来越广泛的应用，也是我们课题组采用的主要方法. 就近几年来拆分手性化合物的一些方法和研究成果本文进行综述，并对今后手性拆分技术的发展方向进行了展望.

手性气相色谱柱；手性液相色谱柱；手性薄层色谱板；旋光检测器；手性高分子膜

Abstract: Chirality is one of the basic properties in nature, different chiral monomers have distrinct physiological activities, the effective separation of chiral compounds is of great significance. Chromatography and membrane separation method have been presented increasingly wide application in the separation of chiral compounds, and are also the major methods our research group used. In this paper, some methods and research results of separating chiral compounds in recent years are reviewed, and the future developmental direction of chiral separation technology is prospected.

Keywords: chiral gas chromatography column; chiral liquid chromatography column; chiral thin layer chromatography plate; polarimetric detector; chiral polymer membrane

手性是自然界和生命体系中最常见的一种现象. 手性物质在生命科学、医学、化学等多个领域都具有很重要的作用，与人们的健康息息相关. 尤其是手性药物，经常会表现出不同的生物活性和药用价值，往往是其中一种对映体具有疗效，与之相应的另一种异构体则没有或者产生相反的药效，甚至会表现出毒副作用[1]. 因此拆分手性化合物得到具有单一活性的对映体是非常有必要的，目前已经开展了许多对映体分离的研究工作，其中色谱技术和膜分离技术是最具成效和最方便的方法，而色谱法拆分技术包括气相色谱法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法等，这些方法也是我们团队采用的主要方法. 该文主要介绍了我们课题组近几年的一些研究工作.

1 用手性无机纳米材料作固定相制备高温气相色谱手性柱

无机介孔材料是孔径介于2～50 nm的多孔材料，具有大的比表面积、结构规则及孔的大小可调控等特性，因此是一种较好的色谱基质材料. 在无机介孔材料中设计手性，并用于手性分离、催化、传感等领域都具有重要意义[2-4]. 手性向列型介孔硅(CNMS)是一种新颖的手性无机介孔材料，由于向列型结构，其具有手性、孔径大、耐高温、成本低、易合成等优点引起了广泛的关注，它是由纳晶纤维素(NCC)与四甲氧基硅烷(TMOS)缓慢挥发诱导自组装形成的NCC-硅复合膜，然后在高温下煅烧而制备的[5]. 在毛细管气相色谱中我们用CNMS作为固定相，制得了CNMS气相色谱柱. 该柱不仅能分离线性烷烃、芳香烃、多环芳烃和同分异构体，而且对手性化合物也具有良好的手性识别能力，比如1,2-氨基-1-丁醇衍生物的拆分，如图1所示. CNMS这种材料具有耐高温，稳定性好的特性，它可以应用于高于350 ℃的高温气相色谱，该柱分离样品时出峰快，节省时间[6]，具有作为高温手性气相色谱固定相的潜在应用前景.

2 用手性多孔有机笼CC3-R作固定相制备高分辨气相色谱柱

近年来，多孔有机笼材料作为一种新型的多孔材料，因其潜在的应用价值引起科学家的广泛关注. 多孔有机笼(POCs)是由单独的笼分子通过较弱的分子间作用力堆积组装形成一种形状较稳固的三维空间结构的材料[7-8]. 这些材料的合成方法一般是由醛和伯胺缩合反应形成席夫碱亚胺，最典型的是由1,3,5-均苯三甲醛或三(4-甲酰苯基)胺和一些二胺通过席夫碱环缩合反应制得一系列的具有永久孔穴的有机分子笼材料[9-18]. 其中的CC3-R是由1,3,5-均苯三甲醛与(R,R)-1,2-环己二胺环缩反应制得的一种单一手性的亚胺分子笼[10-11,18]. 我们团队用合成的CC3-R加聚硅氧烷(OV-1701)溶在二氯甲烷里作为毛细管气相色谱固定相. 该柱能拆分手性醇、酯、醇胺、胺、酮、醚、有机酸、卤代烃、氨基酸甲酯和亚砜这些手性化合物，并且正构醇混合物、正构烷烃混合物、位置异构体和芳香烃混合物也得到很好的分离[19]，比如1,2-环氧丁烷的拆分色谱图，如图2所示. 相比于全甲基-β-环糊精和氨基酸衍生物的Chirasil-L-Val等商品柱，CC3-R柱表现出了更好的手性识别能力，且重现性好，热稳定性高，使CC3-R成为很有前景的毛细管气相色谱手性固定相[19-20]. 这项工作还表明，多孔有机分子材料将会在分离科学中变得更有吸引力，商业前景广阔.

图2 1,2-环氧丁烷在CC3-R涂敷的气相色谱柱 上的分离色谱图Fig.2 GC chromatograms on CC3-R coated open tubular column for separation of 1,2-epoxybutane

3 制备新型冠醚类手性柱用于高效液相色谱拆分氨基酸

手性冠醚作为手性选择剂，多用于伯胺基化合物和氨基酸的分离. 我们团队以R-联萘酚为原料合成了3种新型R-(3,3'-卤基-1,1'-二萘基)-20-冠-6(卤基= Cl、Br和I)，将其涂敷在C18硅胶上制成手性冠醚柱，在室温条件下用于高效液相色谱中对21种α-氨基酸进行拆分，其中R-(3,3'-溴基-1,1'-二萘基)-20-冠-6(CSP-1)能拆分全部21种氨基酸，R-(3,3'-氯基-1,1'-二萘基)-20-冠-6(CSP-2)能拆分除脯氨酸以外的20种氨基酸，说明这两种冠醚对α-氨基酸具有优秀的手性拆分性能[21-22]. CSP-1柱相比于其他两个卤素取代的冠醚柱具有更好的对映体选择性，拆分过程中有15种α-氨基酸达到基线分离[22]，比如对羟基苯甘氨酸的拆分，图3所示. 手性冠醚CSP-1柱和CROWNPAK CR(+)商品柱相比，手性冠醚CSP-1柱优于商业冠醚柱，其手性识别能力更强，在相同条件下天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、丝氨酸、组氨酸在CROWNPAK CR(+)商品柱不能得到拆分而在CSP-1柱可以拆分[22]. 另外，手性冠醚CSP-1柱的合成步骤和制备过程相比于CROWNPAK CR(+)商品柱更加简单，这将使手性冠醚CSP-1柱在实际应用中更广泛，应能成为拆分α-氨基酸手性分离的首要选择.

图3 对羟基苯甘氨酸在CSP-1柱的拆分色谱图Fig.3 HPLC chromatogram for the separation of 4-hydroxyphenylglycine on CSP-1 based column

4 研制手性薄层板用于手性化合物的拆分

薄层色谱法[23]具有操作简单、分析速度快、结果直观、经济实惠等优点，并且还能快速更换流动相，在生化、医药、化工等各个领域被广泛使用[24-25]. 近年来薄层色谱在手性分离中的应用也引起了人们的重视. 我们团队根据薄层色谱法拆分手性化合物的原理，调整了试验中的各种条件，制得了多种手性薄层板. 我们能用薄层板再现性地分别拆开丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、丝氨酸、苯甘氨酸、对羟基苯甘氨酸这些氨基酸，以及扑尔敏、美托洛尔、氨氯地平、四咪唑等手性药物，其中对丝氨酸的色谱图如图4. 如最典型的万古霉素薄层板不仅能拆分多种氨基酸，与商业的(2S,4R,2'RS)-4-羟基-1-(2'-羟基十二烷基)-脯氨酸薄层板相比，生产成本很低，使用费用能承受一次性使用，薄层色谱板上的薄层更牢固，并且可以用铅笔在该薄层色谱板上标记而不损坏板上的手性薄层，具有极大的商业应用价值[26].

图4 手性薄层板对丝氨酸的色谱图Fig.4 Chromatogram of serine on chiral thin layer plate

5 自制能用于高效液相色谱的旋光检测器

课题组研制了与高效液相色谱配合使用的旋光检测器，其结构可基本分为：光源、单色滤光片、光源供电电源、起偏器、起偏器旋转驱动系统、起偏器旋转光电编码器、法拉第磁光调制线圈及柱形透镜、磁光调制线圈供电电源、流动相在线检测池、检偏器、光电检测传感器、前置放大器、光电倍增管高压电源、起偏器驱动电路、角度采集电路和单片机处理器、旋光仪控制系统软件等，如图5所示. 设计仪器的目的是与高效液相色谱配合，连接在高效液相色谱出液端，用于定量检测样品的旋光特性，区分样品的右旋或左旋手性特征. 该样机完全达到预计参数指标，其最小读出的旋光角度为0.002度，重复性0.03度[27]. 其填补了我国在高效液相色谱旋光检测器研究方面的空白.

图5 高效液相色谱的旋光检测器的原理图Fig.5 Schematic diagram of polarimetric detector for high performance liquid chromatography

6 研究能用于毛细管电泳的旋光检测器

仪器设计的目的是与高效毛细管电泳仪配套使用. 在不改动高效毛细管电泳仪的情况下，将高效毛细管电泳出液端引出，用于检测样品的旋光特性，区分其为右旋还是左旋，图6是D-扁桃酸的旋光检测图. 由于旋光检测的光程和旋光角度大小成正比，因此不能通过减少旋光测量光程的方法减少待测液体的体积，只能在连接、样品池、接口和角度检测方法上做改进，其余与分析型高效液相色谱旋光检测器原理基本一致. 其基本结构可以分为：光源、单色滤光片、光源供电电源、起偏器、法拉第磁光调制线圈及柱形透镜、调制线圈供电电源、数控可调交直流混合电源、流动相在线检测池、检偏器、光电检测传感器、前置放大器、光电倍增管高压电源、AD采样以及单片机相位分析系统、旋光仪控制等系统软件. 该样机能对样品进行定量检测，性能也超过了预计的指标. 在高效毛细管电泳与旋光检测器的连接问题上，采用多通结构模块，解决了毛细管柱与检测器的接口问题；同样采用多通结构模块，以及进一步减小流通池内径的办法，解决了毛细管电泳流出液体很少、难于检测的问题. 其是国际上第一台用于毛细管电泳的旋光检测器[28].

图6 D-扁桃酸的旋光检测图Fig.6 Polarimetric analysis of D-mandelic acid

7 制备手性高分子膜并提出手性固膜的分离机理

在众多的手性分离方法中，膜的分离是一种节能、无污染、应用范围较广、成本低以及容易工业化生产的分离方法[29-30]. 自1986年第一篇有关手性固膜的研究被报道以来[31]，至今仍无商品化的手性膜出售，将手性膜技术应用在工业中也尚未实现[31]，也未见手性膜分离机理的实验研究，针对这些问题，我们团队制得一些手性高分子膜. 例如，由于大环抗菌素是优良的手性识别材料，已被用于手性识别的多个领域，代表性的是万古霉素[1]. 因此我们选择万古霉素作为手性选择剂，1,6-己二异氰酸酯为交联剂，以聚砜膜为基膜，通过界面聚合的方法制得万古霉素复合膜，然后将该万古霉素复合膜固定在自制的膜色谱装置上,用于拆分D,L-苯甘氨酸，在不断调整试验条件后，D,L-苯甘氨酸得到一定程度的分离[32]. 意外的是，在该手性拆分过程中，我们观察到在手性膜分离模式下，膜上优先吸附的是L-苯甘氨酸对映体，但优先透过的却是D-苯甘氨酸对映体，通过这种现象并结合苯甘氨酸外消旋体的缔合特性，提出“吸附-缔合-扩散”的手性膜拆分机理[33]. 并且我们团队用制得的纤维素手性固膜拆分扁桃酸，用海藻酸钠手性固膜和羟丙基-β-环糊精复合膜拆分D,L-对羟基苯甘氨酸，在优化各种条件后分别都得到一定程度的分离，在试验过程中也发现了同样的现象. 为了验证这种手性膜分离机理，分别做了膜吸附、固相萃取、膜色谱及高效液相色谱试验，所有试验结果表明，优先吸附的对映异构体不是优先渗透的对映异构体. 再通过分析扁桃酸和对羟基苯基甘氨酸外消旋化合物的晶体结构，我们认为手性固膜的分离机理也是“吸附-缔合-扩散”，如图7所示.

图7 膜的机理：吸附-缔合-扩散Fig.7 Chiral separation mechanism of “adsorption- association-diffusion” in optical resolution of membrane

8 总结和展望

近年来，随着科学家对手性化合物分离的深入研究，手性分离技术已经取得一定的成绩，但是在工业上对手性化合物的分离依然存在着局限性，例如不同的分离技术应用范围有限、成本高等. 上述这些方法都各有优势和局限性，也具有一定的互补性，正是这些互补性，我们才可以得到更多的单一对映体. 而未来手性分离技术的研究将朝着成本低、分离效率高、简单、快捷、绿色生产等方向发展. 相信经过广大科研者的不断研究，手性分离技术将会越来越成熟.

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StudyonChiralSeparationofChromatography

LI Ke-li, YUAN Li-ming, ZHANG Jun-hui, LI Hong-ning, XIE Sheng-ming, CHEN Xue-xian, WU Peng, WU Yu-ping, ZHU Peng-jing, DUAN Ai-hong, AI Ping

(FacultyofChemistryandChemicalEngineering,YunnanNormalUniversity,Kunming650500,China)

O657.7

A

1006-3757(2017)03-0159-06

10.16495/j.1006-3757.2017.03.003

2017-07-10;

2017-08-23.

国家自然科学基金(21365025)

李克丽(1992-)，女，硕士，主要从事手性分离研究，E-mail: 841819334@qq.com

袁黎明，男，博士，教授，主要从事手性分离方面的研究，E-mail: yuan_limingpd@126.com.