野百合碱诱导肺动脉高压大鼠右心室脂肪酸代谢紊乱的机制

韩婷，权磊，胡婷婷，刘青，张宝，谭文

(1华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006；2广东工业大学生物医药研究院)

野百合碱诱导肺动脉高压大鼠右心室脂肪酸代谢紊乱的机制

韩婷1，权磊1，胡婷婷1，刘青1，张宝1，谭文2

(1华南理工大学生物科学与工程学院，广州510006；2广东工业大学生物医药研究院)

目的观察野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心室CD36、过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPAR α)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPAR γ)的表达情况，探讨肺动脉高压大鼠右心室脂肪酸代谢紊乱的机制。方法24只大鼠随机分成对照组10只和观察组14只。观察组通过一次性腹腔注射60 mg/kg野百合碱来建立肺动脉高压模型，对照组腹腔注射相同剂量的生理盐水。4周时通过右心导管法测定大鼠的平均右心室压(mRVP)以及右心室收缩压(RVSP)；称量右心室(RV)、左心室+室间隔(LV+S)的质量，计算右心肥厚指数[RV/(LV+S)]；采用实时荧光定量PCR方法检测右心室CD36、PPAR α、PPAR γ的mRNA表达的变化。结果4周时，观察组mRVP和RVSP高于对照组(P均<0.05)，肺动脉高压模型建立成功。 对照组右心室心肌肥厚指数、心肌细胞横截面积分别为0.20±0.02、 (290.32±28.16) μm2，观察组分别为0.40±0.07、(187.92±21.15)μm2，两组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。对照组右心室CD36、PPAR α、PPAR γ mRNA相对表达量分别为1.00±0.00、1.00±0.00、1.00±0.00，观察组分别为1.26±0.08、0.71±0.06、0.48±0.09，观察组右心室CD36表达量高于对照组，PPAR α、PPAR γ的表达量低于对照组(P均<0.05)。结论野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠右心室CD36的表达增加和PPAR α、PPAR γ表达减少，导致右心室脂肪酸利用水平降低，形成脂毒性，引起右心室功能紊乱。

肺动脉高压；右心室脂肪酸代谢紊乱；野百合碱；CD36；过氧化物酶体增殖剂激活受体α；过氧化物酶体增殖剂激活受体γ

肺动脉高压(PAH)是一种复杂的、多因子疾病，肺动脉高压诱发的肺血管阻力升高会增加右心室负荷，导致患者心衰和死亡。研究发现，肺动脉高压患者右心室能量代谢的主要特点是糖利用增加和脂肪酸利用减少[1，2]。 脂肪酸转运分子CD36以及糖代谢、脂肪氧化调节因子过氧化物酶体增殖剂激活受体α(PPAR α)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPAR γ)[3]的表达异常，可导致脂肪酸代谢不良，脂肪酸以甘油三酯、甘油二酯和神经酰胺的形式储存在胞质中，形成脂毒性[3～5]。2016年5～ 10月，我们观察了野百合碱导致的肺动脉高压大鼠右心室组织CD36、PPAR α、PPAR γ的mRNA的表达变化。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 24只SPF级雄性SD大鼠[南方医科大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK(粤)2011-0015]，体质量250～280 g。野百合碱(Sigma，批号:WXBC1381V)，RNAisolater Total RNA extraction Reagent, HiScript Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR(+gDNA wiper), SYBR Green Master Mix (南京诺唯赞生物科技有限公司)。Powerlab数据采集分析系统(AD Instruments Inc)，荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystem7500 Real Time PCR System)

1.2 大鼠分组及肺动脉高压模型的制备 24只大鼠随机分成对照组10只和观察组14只。观察组大鼠一次性腹腔注射60 mg/kg的野百合碱，制作肺动脉高压模型，对照组注射同等体积的生理盐水。

1.3 肺动脉高压大鼠右心室压力测定 野百合碱注射4周，腹腔注射0.3%戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉，然后仰卧固定在实验台上，剪掉大鼠颈部的毛，并用碘酊消毒。分离右颈外静脉，进行颈外静脉插管，用右心导管法测定大鼠的平均右心室压(mRVP)和右心室收缩压(RVSP)。导管中充满0.1%的肝素，并通过三通阀与压力传感器相连，同时用Powerlab对波形进行记录。进行右心室插管的时候，要时刻密切关注波形的变化。导管依次进入上腔静脉、右心房，最后到达右心室。待右心室波形稳定后，进行波形记录，每只大鼠记录30 min。

1.4 心肌肥厚指数、心肌细胞横截面积检测 血流动力学的测定完成后，处死大鼠，并取出右心室，用提前配制好的磷酸盐缓冲液进行冲洗，然后将清洗过的组织标本用滤纸擦干，并小心分离右心室，分别称量右心室(RV)、左心室+室间隔(LV+S)的质量，以RV/(LV+S)作为右心肥厚指数。将右心室平分两份，一份用4%的多聚甲醛固定，并进行石蜡包埋切片，切片厚度为4 μm，用于HE染色。HE染色切片在200倍显微镜下选择3个区域拍照，每个区域20个细胞，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算右心室心肌细胞横截面积。一份立刻投入液氮中保存，并转移至-80 ℃冰箱中长期保存，以备后期的mRNA的检测。

1.5 心室组织CD36、PPAR α、PPAR γ检测 采用实时荧光定量PCR法。从-80 ℃冰箱中取50 mg右心室组织，加入1 mL Trizol在冰上磨碎，严格按照说明书提取RNA，进行反转录和扩增。β-actin作为内参，2-ΔΔCt表示各个基因的相对表达量。所用引物由上海捷瑞合成，其序列为：CD36 上游引物5′- GGTGTGCTGGACATTGG-3′ ,下游引物5′- CTATGCTCATCTTCGTTAGG-3′;PPAR α 上游引物 5′-TGTATGAAGCCATCTTCACG-3′,下游引物5′-GGCATTGAACTTCATAGCGA-3′;PPAR γ 上游引物 5′-TCAAACCCTTTACCACGGTT-3′，下游引物 5′-CAGGCTCTACTTTGATCGCA-3′; β-actin 上游引物：5′-CTACAGCTTCACCACCACAGC-3′,下游引物 5′-CATTGCCGATAGTGATGACCT-3′。反转录反应条件：50℃ 15 min，85℃ 2 min；实时荧光定量PCR的条件：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环。

2 结果

2.1 两组右心室压力及结构变化 见表1。

表1 两组右心室压力及结构变化比较

注：与对照组比较,*P<0.05。

2.2 两组右心室CD36、PPAR α、PPAR γ mRNA相对表达量 见表2。

表2 两组右心室CD36、PPAR α、PPAR γ mRNA相对表达量的比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

右心室心衰是肺动脉高压死亡的主要原因[6]，且右心室代谢紊乱被证实在肺动脉高压导致的心衰中起重要作用。本研究通过一次性腹腔注射60 mg/kg野百合碱建立肺动脉高压模型，显示与对照组相比，观察组右心室心肌肥厚指数、心肌细胞横截面积均增大，肺动脉高压大鼠存在右心室结构和功能紊乱情况。

有研究报道[7]，右心室功能紊乱与异常能量代谢的基因表达改变有关。过氧化物酶体增殖剂激活受体(PPARs)是一个核受体的亚家族，在调节能量平衡、糖脂代谢中起重要作用。PPARs主要有3种表型(α、β/δ和γ)，三种异型体都可以被脂肪酸和其代谢产物活化。PPAR α主要存在于肝脏、肌肉以及肾脏中，其主要功能为调节脂肪酸氧化以及糖的稳态平衡。有研究表明在低氧导致肺动脉高压的动物模型中PPAR β/δ 激动剂 GW0742可以减轻右心室肥厚、降低收缩压[8]。研究表明，大部分的肺动脉高压患者的肺组织中PPAR γ的表达量显著减少[9]。PPAR γ可以抑制内皮细胞中趋化因子的产生以及NF-κB的激活[10]，还可以抑制细胞间粘附因子以及血管细胞粘附因子的产生。除此之外，PPAR γ可以增加内皮细胞中一氧化氮的产生，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移[11]。本研究表明，与对照组相比肺动脉高压大鼠右心室PPAR α、PPAR γ的表达均显著减少，表明右心室脂肪酸的氧化能力减弱。

CD36是健康人心脏的主要脂肪酸转运分子，负责大约70%心肌细胞的脂肪酸摄取[12]。在各种由脂毒性导致的心脏收缩功能紊乱的心脏代谢疾病中，CD36均发挥重要作用。CD36作为脂毒性中的一个关键分子，是抑制或治疗胰岛素抵抗相关心脏收缩功能紊乱的主要靶点。在一个存在PPAR α表达但缺少CD36表达的心脏脂毒性小鼠模型中，尽管脂肪酸的利用情况基本不变，但心肌细胞中甘油三酯代谢紊乱和心脏功能紊乱均减轻，糖的摄取和氧化增加，这表明CD36表达增加对脂毒性心肌病的发展有重要作用。并且，目前采用新型药物有针对性地抑制CD36介导的脂肪酸摄取，可以阻止或治疗心脏功能紊乱。敲除CD36基因可以抑制代谢压力对心脏的不良影响。Talati等[13]的最新研究表明，在BMPR2突变的小鼠的肺动脉高压模型中，其右心室CD36的表达是增加的；同样一个左心衰的模型中，右心室的肥厚也伴随着CD36的表达而增加。然而，CD36在右心室脂毒性的作用仍然不清楚。在肺动脉高压中，右心室脂毒性可能是导致右心室功能紊乱的重要原因。本研究表明肺动脉高压伴随的右心室功能紊乱过程中CD36的表达量显著升高，从而使CD36转运的脂肪酸含量升高，但是PPAR α、PPAR γ表达减少，导致右心室脂肪酸利用水平降低，形成脂毒性，引起右心室功能紊乱，促进了动脉高压病情进展。

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谭文(E-mail：went@gdut.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.009

R543.2

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1002-266X(2017)33-0029-03

2016-12-01)