牦牛乳清中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白的热聚合反应

王立枫，马莺，李琳，崔杰

（哈尔滨工业大学化工学院，哈尔滨150090）

牦牛乳清中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白的热聚合反应

王立枫，马莺，李琳，崔杰

（哈尔滨工业大学化工学院，哈尔滨150090）

通过使用体积排阻色谱法检测不同加热温度和不同加热时间对牦牛乳清蛋白形态及质量分数变化的影响。当加热温度达到80～90℃溶液中蛋白发生了不同程度的聚合，蛋白聚合质量分数随着加热温度及加热时间的增长呈现上升趋势，同时α-乳白蛋白与β-乳球蛋白含量明显降低。当加热温度未达到80℃时，溶液中没有蛋白聚合的产生。结果表明，当加热温度高于β-乳球蛋白的变性温度会导致蛋白聚合的产生，同时表明β-乳球蛋白在蛋白聚合中起主导地位。

牦牛乳；α-乳白蛋白；β-乳球蛋白；热诱导；蛋白聚合.

0 引 言

牦牛是我国特色资源，其生存环境有海拔高、昼夜温差大牧草生长期短，大气压低含氧量少，无污染的环境等特点[1]。现今世界共有牦牛1 600万头，我国有1 500万头左右占有量达世界牦牛总数90%以上[2]。随着牦牛数量逐渐增加，牦牛周边经济重要性仅在水牛和黄牛之后排第三位[3]。

相对于牦牛数量及牦牛奶产量逐渐增加，对牦牛乳乳清蛋白的基础研究略显不足。牦牛乳清蛋白是牛乳蛋白中的主要的组成部分其主要成分为α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。乳清蛋白其特有性质如乳化性质及凝胶性质等重要功能特性在食品应用中起到重要作用[4]。本研究采用体积排阻色谱（SEC）研究α-乳白蛋白和β-乳球蛋白经不同加热时间及加热温度后溶液中蛋白的聚合形态及含量。

1 实 验

1.1 材料

本研究所用牦牛乳采自四川红原县牦牛乳样品，采集的样品加入质量分数为0.03%的叠氮化钠并在-18℃冷冻，采集后迅速送回实验室进行牦牛乳热稳定性的研究。

1.2 仪器设备

Agilent 1100高效液相色谱仪，体积排阻色谱柱TSKG3000SWXL，液相色谱柱JupiterC4 column。超高速离心机，美国密理博Millipore超滤系统。

2 方法

2.1 牦牛乳清蛋白的制备

牦牛乳流水室温解冻后3 000 g离心，离心温度4℃离心时间30 min去除牦牛乳中的脂肪。再使用超高速离心机离心90 000 g，离心温度4℃离心时间30 min后取其上清液得到牦牛乳乳清蛋白。将取得的牦牛乳清蛋白经超滤系统50 ku膜过滤取滤过液即为乳清中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白。

2.2 牦牛乳清蛋白的热处理

取3 mL牦牛乳清蛋白至于10 mL试管中，使用水浴锅加热至60，70，80，90 ℃；加热时间为10，20，30 min；加热后取出冷却至室温，以未加热乳清蛋白对照。

2.3 使用液相色谱检测分离乳清蛋白种类及质量分数

牦牛乳蛋白分析参考Li等人的方法[5]。选用Sig⁃ma公司的牛乳酪蛋白和乳清蛋白质标准品。取1mL牦牛脱脂乳分散到4 mL缓冲液中（浓度为8 mol/L尿素，0.165 mol/L的Tris，浓度为0.044 mol/L柠檬酸钠和体积分数为0.3%的二巯基乙醇）。RP-HPLC系统：Agilent1100。柱类型及规格：JupiterC4 column（250 mm× 4.6 mm，300Asizedpores，5 μm sized parti⁃cles）。检测波长为220 nm，温度为30℃，进样量为20 μL，洗脱液流速为0.8 mL/min。洗脱液：A和B两种洗脱液，A为色谱纯的水（加质量分数为0.1%的三氟乙酸），B为色谱纯的乙腈（加质量分数为0.1%的三氟乙酸）。洗脱条件为：上样前先用A液平衡，上样后0～40 min B液质量分数从30%升到50%；40～42min的B液质量分数从50%升到100%；42～43 min B液质量分数为100%；43～46 min B液浓度从100%降到30%，然后再用起始洗脱液洗脱5 min，总洗脱时间为51 min。用牦牛乳的HPLC图谱对比对照分离出的乳清蛋白的纯度及蛋白质量分数。

2.4 排阻色谱分析乳清聚合蛋白形态及质量分数

牦牛乳清蛋白分析参考Thomas[6]的试验方法。选用Sigma公司的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白各50 mg，作为标准对照样品对照牦牛乳清相应蛋白。将加热后牦牛乳清蛋白样品经0.45 μm滤膜过滤取滤过液。SEC-HPLC系统：Agilent 1100。柱类型及规格TSK G3000SWXL（300 mm×3.8 mm i.d.）。色谱柱与Agilent 1100高效液相色谱仪相连接，检测波长280 nm，使用浓度为0.1 mol/L的Na2SO4，质量分数为0.05%的NaN3浓度0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.7），进样量10 μL，流速1.0 mL/min。

3 结果与分析

3.1 液相色谱检测分离的乳清蛋白

使用液相色谱检测超速离心后经超滤系统处理后得到的乳清溶液，结果如图1所示。得到的牦牛乳乳清溶液中，只含有α-乳白蛋白和β-乳球蛋白两种乳清蛋白，并且没有其他乳清蛋白以及酪蛋白存在。这是因为高速离心条件下可以使酪蛋白与乳清蛋白分离，经过50 ku超滤后可以使分子量大于50 000 u的乳清蛋白以及可溶于溶液中的少量酪蛋白与α-乳白蛋白及β-乳球蛋白分离。通过检测数据计算得出溶液中牦牛乳清中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白两种蛋白质量分数的比例约为1∶5，其质量分数比例与牛乳相比略低，这是因为牦牛乳中α-乳白蛋白的质量分数自身较低[7]。

3.2 不同加热温度对蛋白聚合形态的影响

图1 分离得到的牦牛乳清溶液

样品于60～90℃水浴加热，加热10 min后与未加热样品对照，结果如图2所示。图2中，在未加热的乳清中，溶液中没有α-β二聚体和蛋白聚合体的形式存在。当加热温度增加至60℃和70℃，样品中虽然有α-β二聚体生成，但没有蛋白聚合体产生。当加热温度增加至80℃样品中蛋白聚合产生其质量分数为16.95%，随着加热温度增加至90℃蛋白聚合质量分数达到最高的51.70%。而同时α-β二聚体的质量分数则随着温度的升高呈现是先增加而后降低的趋势。当加热温度增加至60℃时α-β二聚体产生，加热温度达到70℃其质量分数增加至最高的1.63%，之后质量分数则随加热温度增加质量分数呈下降趋势，当加热温度增加至90℃其质量分数降低至1.23%。同时β-乳球蛋白的四倍体、双倍体以及其单体形态，α-乳白蛋白的质量分数都是随温度的增加而呈现逐渐降低的趋势。相对未加热样品，其占蛋白质量分数比例分别降20.37%，2.18%，21.33%以及8.85%。在加热温度不高于70℃时，蛋白质量分数变化并不明显，当加热温度增加至80℃溶液中各蛋白质量分数比例变化有明显增加至18%，在90℃时蛋白质量分数变化明显，其中蛋白聚合质量分数高于50%，同时α-乳白蛋白与β-乳球蛋白质量分数分别降低至35%和10%。

加热至60℃，α-β二聚体出现是因在60℃时牦牛α-乳白蛋白发生变性，因此与β-乳球蛋白形成了少量的α-β二聚体。并在70℃条件下质量分数增加，当加热温度增至80℃溶液蛋白聚合产生，是因为β-乳球蛋白的变性温度在80℃左右[8]，因此80℃条件下变性的乳清蛋白形成了蛋白聚合，其蛋白质量分数约占18%，随着变性温度增加至90℃，加热温度明显高于β-乳球蛋白变性温度，乳清蛋白变性质量分数有显著增加，蛋白聚合增幅明显达到23.8%，同时其他蛋白质量分数明显降低。由于蛋白产生聚合因此溶液中各种蛋白形态的质量分数都有明显的降低，α-乳白蛋白在加热后与β-乳球蛋白产生蛋白聚合，但在加热至80℃条件下蛋白质量分数降低不明显，当加热至90℃蛋白聚合质量分数有显著增加，同时α-乳白蛋白与β-乳球蛋白质量分数也随之明显降低。

加热可以导致乳清蛋白游离的巯基活性增加，进而导致蛋白中巯基与二硫键产生交换重组，促使蛋白产生聚合。α-乳白蛋白中没有游离的巯基，而β-乳球蛋白中含有游离的巯基，所以β-乳球蛋白在蛋白聚合中起到了决定作用，因此当加热温度达到80℃有蛋白聚合的产生[9]。

3.3 加热时间对蛋白聚合及质量分数的影响

在加热至60℃与70℃条件下，虽然α-乳白蛋白发生变性，但β-乳球蛋白没发生变性，因此其在蛋白聚合中并不起到主要作用，也表明β-乳球蛋白在蛋白聚合中起到主要作用[10]。由图2可以看出，在加热至60℃以及70℃加热对蛋白质量分数没有明显影响，因此后续实验主要针对加热至80℃与90℃进行研究。相同加热温度的条件下，分别对乳清蛋白加热10，20及30 min结果如图3所示。

图2 不同加热温度加热10 min蛋白种类及质量分数的变化

当温度增加至80℃蛋白质量分数随加热时间增加有不同程度的增加。在80℃加热10，20，30 min后蛋白的聚合体质量分数分别为9.2%，12.7%，14.4%。表明在加热80℃蛋白聚合质量分数随加热时间延长而明显增加。同时乳清中其余蛋白形态质量分数都有不同程度的降低，其中β-乳球蛋白的减少尤为明显，表明加热温度达到β-乳球蛋白变性温度时，β-乳球蛋白的蛋白变性质量分数随加热时间的增加有明显增加。同时α-乳白蛋白的质量分数有少量降低，说明α-乳白蛋白在80℃只有少量参与蛋白聚合中。

图3 不同加热温度及时间质量分数的变化

当加热温度增加至90℃蛋白聚合质量分数在加热10，20及30min后分别为23.1%，26.7%及30.0%。乳清溶液中各种蛋白形态的质量分数都有明显的降低，说明加热至90℃由于加热温度明显高出β-乳球蛋白的变性温度，进而使得大量的乳清蛋白变性导致蛋白聚合产生，蛋白聚合虽然随加热时间的增加而呈现上升趋势，但质量分数增幅不明显。表明当加热温度明显高于β-乳球蛋白变性温度的条件下，乳清中蛋白聚合的质量分数会有显著的增长，同时在高温加热条件下，加热时间的延长虽然可以使得蛋白聚合质量分数增加但相对加热温度对蛋白聚合影响甚微。

4 结论

（1）牦牛乳清蛋白溶液加热聚合的过程中β-乳球蛋白与α-乳白蛋白都参与了蛋白聚合的过程。α-乳白蛋白在蛋白聚合的加热过程中参与的质量分数与β-乳球蛋白相比有明显偏低。加热温度低于80℃在溶液中没有蛋白聚合的产生，表明在β-乳球蛋白在加热变性之后溶液有蛋白聚合出现，也表明了在牦牛乳中β-乳球蛋白在蛋白聚合的过程中起主导地位。

（2）当加热温度高于80℃时，牦牛乳乳清蛋白聚合的产生随着加热温度以及加热时间的增加而呈现上升趋势，当加热至90℃乳清溶液中蛋白聚合有显著增长其聚合质量分数超过20%。此时加热时间的延长只会使得蛋白聚合有少量的增加。因此在蛋白加热聚合的过程中加热温度在蛋白聚合中占据主导地位。

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[2]李景芳，叶东东，陆东林，等.牦牛的生物学特性和生产性能[J].西藏畜牧业，2015（4）：39-40.

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[9]ALOMIRAH H，ALLI I.Chargestatedistributionandhydrogen/deuteri⁃umexchangeofα-lactalbumin andβ-lactoglobulinpreparationsbyelectr osprayionizationmassspectrometry[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003（51）：2049-2057.

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Aggregation reaction of heat-induced yakα-Lactalbumin andβ-Lactoglobulin

WANG Lifeng，MA Ying，LI Ling，CUI Jie

（Chemical Engineering and Technology，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

Effect of yak whey proteins content and formations at different heat-treatment temperature（60～90 ℃）and heat-treatment time（10～30 min）were analyzed by SEC-HPLC.Protein aggregation was appeared at heating temperature 80 and 90 ℃ but the content was sig⁃nificant difference.The content of protein aggregation was increased with heating temperature and heat-treatment time increase，meanwhile the content ofα-Lactalbumin andβ-Lactoglobulin was decreased markedly.Aggregation was not appeared at heating temperature below 80℃ because aggregation was formed at heating temperature aboveβ-Lactoglobulin denaturation temperature.The results indicate that β-Lactoglobulin play dominant role in whey protein aggregation.

yak milk；α-Lactalbumin；β-Lactoglobulin；heat treatment；protein aggregation

Q936

A

1001-2230（2017）08-0011-03

2016-09-13

王立枫（1983-），男，博士，从事牦牛乳加热聚合机制的研究。

马莺