一种新型原位前列腺癌种植小鼠模型的建立及其应用

夏 晴 孙顺吉 刘 峰 孙业全 崔晓聪

1. 潍坊医学院医学影像学系（山东潍坊 261000）；2. 潍坊医学院附属医院血管介入科

一种新型原位前列腺癌种植小鼠模型的建立及其应用

夏 晴1孙顺吉2＊刘 峰1孙业全1崔晓聪1

1. 潍坊医学院医学影像学系（山东潍坊 261000）；2. 潍坊医学院附属医院血管介入科

目的 建立一种新型C57BL6近交系小鼠前列腺癌种植瘤动物模型，观察其生物学特性，并探讨其应用价值。方法 将40只C57BL6近交系小鼠随机平均分为两组：原位组和皮下组，每组20只。在10倍显微镜辅助下将小鼠前列腺癌块分别植于原位组小鼠前列腺组织内和皮下组小鼠皮下，观察两组小鼠的肿瘤转移情况及生存期，并比较两组结果差异是否具有统计学意义。结果 原位组动物在建模后第 13～22天出现一般状态衰竭，下腹可触及包块，解剖见癌组织广泛浸润周围盆腔脏器，发生淋巴结转移（16/20）和肺部转移（12/20）；皮下组动物生命晚期未出现远处转移。两种模型荷瘤鼠生存时间相比差异有统计学意义（P＜0.01）。原位组小鼠（17.0±3.5）d 短于皮下组（31.8±4.6）d。结论 小鼠前列腺癌瘤块原位种植瘤模型可较好地模拟人类前列腺癌自然生长状况，适于观察前列腺癌在人体环境条件下的生物学行为特性。小鼠前列腺癌皮下种植瘤模型具有较长的生存期，有望用于前列腺癌的实验治疗研究。

前列腺肿瘤; 肿瘤种植; 肿瘤转移; 动物, 实验

近年来，我国前列腺癌的发病率呈现明显持续增长趋势,前列腺癌正成为严重影响我国男性健康的泌尿生殖系统恶性肿瘤[1]。但由于前列腺癌发病较隐蔽，导致30%～50%的患者因发生远处转移而丧失手术治疗的机会[2]。所以，研究在人体环境条件下前列腺癌的生物学特性，对前列腺癌的诊断和治疗具有重要意义。动物模型可以用来了解疾病的发生机制、发展规律以及探索疾病的治疗方法。因此，我们利用新方法建立了C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位种植瘤模型，并将其生物学特性与现行的皮下种植瘤模型相比较，探讨两种方式建立的模型在研究有关前列腺癌生物学特性及判断药物疗效方面的应用价值。

材料和方法

一 实验动物

C57BL6 雄性近交系小鼠43只[济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）2014007]。鼠龄 8 周，体质量 18～20g，饲养环境恒温、恒湿、清洁，定期更换垫料、清洁饮用水及饲料供小鼠自由摄入。RM-1小鼠前列腺癌细胞株，由中国科学院细胞库提供。生长于RPMI 1640完全培养液中，在 37℃、5% CO2的孵箱内培养，用0.25%胰酶消化传代。

二、荷瘤鼠的建立

将处于对数期的RM-1细胞配成2×107个/mL浓度的溶液，用碘伏消毒小鼠背部，用微量注射器取上述RM-1前列腺癌细胞溶液接种于小鼠背部皮下，建立荷瘤鼠3只，每只接种100μL 。每日观察小鼠的一般情况。

三、小鼠前列腺癌移植瘤模型的建立

3周后，将荷瘤鼠的瘤组织取出，置于无菌的生理盐水中，去除边缘纤维结缔组织，在 10倍显微镜下将瘤组织切割成1.0mm3大小的组织块，暂存于15mL针头内（每次取1粒），以瘤粒位于针头头端为最佳，针头尾端连接1mL注射器。（1）原位组模型建立：用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠（0.2ml/只），仰卧位固定于10倍显微镜的玻璃台上，强力碘常规消毒，铺无菌洞巾。在耻骨联合上2～4mm处作一长约 1.0cm的正中切口，显露腹腔。将膀胱向上提起后，用眼科镊固定暴露出腹侧前列腺，再用注射器将瘤组织注射到前列腺内，缓慢退出注射器，确认瘤组织无溢出后用5-0肠线全层连续缝合关腹。（2）皮下组模型建立：采用实验室常用方法固定小鼠，用注射器将瘤组织注射至小鼠背部皮下，确认无出血后放回鼠笼。

四、实验观察

以小鼠处于濒死状态时作为其观察终点,过量麻醉处死。取组内最后死亡小鼠的日期作为该组的实验终点。尸解并观察荷瘤部位肿瘤的生长情况，光镜下观察肝、肺及淋巴结等有无转移灶存在。比较两种模型荷瘤鼠的肿瘤转移发生情况及生存期。

五、统计学处理

应用 SPSS 17.0 统计软件进行数据处理。计量资料用x±s表示，两样本计量资料比较采用独立样本 t 检验，率比较采用卡方检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1. 原位组中，20只小鼠的前列腺组织有移植瘤生长，成功率100%。原位种植组动物在第 13天至第22天出现一般状态衰竭，下腹可触及包块，瘤组织广泛浸润周围盆腔脏器，包括输尿管、小肠、精囊、膀胱等（见图1A），20只小鼠全部出现肠梗阻，发生盆腔淋巴结转移的有16只，发生率最高，见图1B；发生肺转移12只，见图1C；发生肝脏转移8只，见图1D；脾脏转移6只。

2. 皮下组中，20只小鼠均有移植瘤生长，但仅有肿瘤局部生长与浸润，未见肿瘤转移发生。两组在建模型成功率上差异无统计学意义；转移率、体质量变化率及生存期差异均具有统计学意义，见表1。

讨 论

图1 原位前列腺癌组织浸润致周围多脏器组织结构破坏

表1 原位组与皮下组各指标的对比

利用C57BL6近交系小鼠建立的前列腺癌动物模型虽然仅是一个鼠源性肿瘤的近交系动物模型，但具有实验条件简便、实验周期快速的优点[3]。前列腺癌动物模型的建立方法按瘤细胞（组织）的接种部位分为皮下种植法和前列腺原位种植法[4]。皮下种植具有接种方便、易于观察等优点，但其生物学行为往往仅有肿瘤的局限性生长和浸润，难以观察到重要的淋巴和血道转移行为。将RM-1小鼠前列腺癌细胞移植于c57bl/6小鼠前列腺组织内建立前列腺癌原位种植模型，这是当前研究前列腺癌常用的动物模型，具有试验结果精度高、可比性好、应激反应均一等优点[5]，无需采用免疫缺陷小鼠。近年来，该模型广泛用于前列腺癌的研究[6,7]。原位接种法虽操作要求高，但却具有很高的转移率。本实验同时采用这两种种植方法建立前列腺癌动物模型，结果显示两种方法虽在种植成功率上无明显差异，但在动物模型的转移发生率和生存期方面均具有明显的差异，皮下接种建立的模型生存期长、转移率低；原位接种建立的动物模型生存期短、转移率高，研究结果与王金秋等[8]学者相一致。王金秋等学者认为肿瘤细胞移植的原发部位更容易显示其生物学特性，更接近人体的生理环境，可以模拟具有一定免疫力的前列腺癌患者的荷瘤状态。选择皮下作为荷瘤部位建立前列腺癌的小鼠模型，虽接种方便、易于观察，但其生物学行为与人前列腺癌差异较大，因此认为皮下移植瘤模型并不能很好地模拟前列腺癌在人体内的自然生长过程,对于研究其病理生理过程、判别药物疗效存在较大的局限性。笔者认为，原位种植法建立的动物模型确实有转移率高的优势，适用于观察前列腺癌组织的生物学行为，但其生存期较短（13～22d），不适用于判别药物疗效，而经皮下种植建立的模型具有较长的生存期，能够为观察药物疗效提供较宽的时间窗，经检索知网等数据库也证实在观察药物疗效的实验中研究者们多采用皮下种植法建立动物模型。

本实验的“新”体现于：（1）建立模型所应用的移植物为前列腺癌RM-1细胞组织块，不是现行方法利用的瘤细胞；（2）真正意义上的原位种植。本研究是利用显微外科技术将瘤组织块种植于前列腺组织内，而郭宝峰等[9]报道的原位种植法是将组织块种植于前列腺两腹侧叶间的腔隙中，不是前列腺组织内，也就不是真正意义上的原位种植。瘤组织块种植的优点：（1）维持了原有肿瘤组织结构及其生物学特性；（2）保留了对于肿瘤生长有重要作用的肿瘤基质；（3）远处转移真实体现了前列腺癌的生物学行为。有研究表明，细胞注射时细胞悬液渗漏到前列腺组织外会使实验结果产生误差，造成肿瘤细胞的人为播散而非真正的转移[10]。注入肿瘤细胞后10min-3h，即使没有直接刺入血管内，也容易产生自发的向淋巴道和血道的转移造成人为的播散[11]，而瘤块种植就不会出现上述现象。

实验心得：（1）瘤组织在生理盐水中不宜存放太久，超过30min易造成瘤组织失活。（2）注射瘤组织和退针时速度要慢，确保瘤组织留在前列腺内。（3）缝合前要确认腹腔无出血点，否则出血的小鼠会遭到同伴攻击。（4）注射器内的空气要适量，以0.05mL为宜，太少时无法将瘤组织释放，过多会造成前列腺组织破裂。

综上所述：前列腺癌组织块原位移植作为一种新型的建模方法，能够为观察前列腺癌的生物学行为和研究前列腺癌转移的机制提供合适的原位模型。小鼠前列腺癌皮下移植瘤模型虽不适用于观察前列腺癌在体条件下的生物学行为特性，但其具有建模条件简便、生存期长等优点，能够用于前列腺癌的实验治疗研究。

1 Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin 2016; 66(2):115 - 132

2 计国义, 张灵, 赵薇, 等. 超声引导下前列腺6点活检诊断早期前列腺癌. 中国男科学杂志 2005; 19(4): 22-24

3 张春, 李惠长, 钱本江, 等. C57BL/6小鼠前列腺癌三种常用动物模型的建立. 中华实验外科杂志 2012; 29(4): 577

4 Li H, Jiang M, Honorio S, et al. Methodologies in assaying prostate cancer stem cells. Cancer Stem Cells. Methods Mol Biol 2009;568: 85-138

5 毕永祥. 小鼠不同部位前列腺癌骨转移模型的建立及方法改进研究. 大理学院 2015

6 Li F, Guo Z, Yu H, et al. Anti-tumor immunological response induced by cryoablation and anti-CTLA-4 antibody in an in vivo RM-1 cell prostate cancer murine model. Neoplasma 2014; 61(6): 659-671

7 Jin L, Li C, Li R, et al. Corticotropin-releasing hormone receptors mediate apoptosis via cytosolic calciumdependent phospholipase A(2) and migration in prostate cancer cell RM-1. J Mol Endocrinol 2014; 52(3): 255-267

8 王金秋,李志,何丹,等. LNCaP前列腺癌原位接种SCID小鼠模型的建立. 黑龙江畜牧兽医 2012; (13): 104-106

9 郭宝锋,张灵,赵丽娟，等.C57BL6近交系小鼠前列腺癌原位移植瘤模型的建立. 中国男科学杂志 2007; 21(5): 5-8

10 An Z, Wang X, Geller J, et al. Surgical orthotopic implantation allows high lung and lymph node metastatic expression of human prostate carcinoma cell line PC-3 in nude mice. Prostate 1998; 34(3):169-174

11 Ishibashi T, Yamada H, Harada S, et al. Distant metastasis facilitated by BCG: spread of tumor cells injected in the BCG- primed site. Br J Cancer 1980; 41(4): 553-561

（2017-04-05收稿）

Establishment of a novel orthotopic prostate cancer mouse model and its application

Xia Qing1, Sun Shunji2＊, Liu Feng1, Sun Yequan1, Cui Xiaocong1
1. Department of Medical Imaging, Weifang Medical University, Weifang 261053, Shandong, China 2. Department of Interventional Vascular of the Affiliated Hospital, Weifang Medical University Corresponding author: Sun shunji, E-mail: sunshunji2008@163.com; Tel: 15854889848

Objective To establish a new orthotopic prostate cancer mouse model and observe its biological characteristics, and explore its application value. Methods Forty C57BL6 syngenic mice were randomly and equally divided into two groups such as the 0.t. (A) group and the subcutaneous (B) group. A slice of mice prostate cancer tissue was orthotopically implanted in prostate tissue of mouse under assistance of 10 times microscope in group A, and a slice of mice prostate cancer tissue was subcutaneously implanted into mice in group B. Mice tumor metastasis and survival were comparatively analyzed between the two groups. Results On the 13th-22nd days after modeling, mice in the o.t. group gradually appeared general state failure, abdominal palpable mass. Anatomy analysis of model showed the invasion of the surrounding pelvic organs. They exhibited pelvic lymph mode metastasis (16/20) and lung metastasis (12/20). No metastasis occurred in the control group except local growth and infiltration. The survival time of the o.t. group (17.0±3.5 days) was markedly shorter than that of s.b. group (31.8±4.6 days). There were significant differences in the rate of metastasis, the maximum diameter and the survival time between two groups. Conclusion The orthotopic prostate cancer mouse model which mimics the natural situation of human prostate cancer is an optimal clinical animal model for metastasis analysis. The subcutaneous model had long survive time for for experimental treatment study of prostate cancer.

prostatic neoplasms; neoplasm seeding; neoplasm metastasis; animals, laboratory

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.04.002

R 737.25

＊通讯作者，E-mail: sunshunji2008@163.com; Tel: 15854889848