薏苡黑穗病拮抗菌的分离鉴定及其发酵条件优化

刘荣+申刚

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.027摘要：采用梯度稀释平板涂布法从土壤中分离并纯化细菌，通过平板对峙法、滤纸片法筛选出拮抗薏苡黑粉菌的细菌，经形态观察、16S rRNA基因序列分析鉴定菌株，并优化其发酵条件。结果表明，共分离得到拮抗菌株16个，其中拮抗菌菌株X-2对薏苡黑粉菌的抑制率相对最高，为66.7%，能够明显抑制病原菌的生长；经鉴定，菌株X-2为枯[JP2]草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其最适发酵条件为温度34 ℃、pH值6.0、转速180 r/min、接种量4%、装液量200 mL/L。[JP]

关键词：薏苡；黑穗病；拮抗菌；鉴定；发酵条件；菌株X-2

中图分类号： S435.19文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0097-04[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-13

基金项目：贵州省科技厅、贵州省农业科学院联合基金（编号：黔科合J字LKN[2013]13）；贵州省农业科学院专项资金（编号：黔农科院院专项[2014]010）；贵州省社会发展科技攻关计划（编号：黔科合SY字[2015]3023-4）。

作者簡介：刘荣（1986—），女，贵州瓮安人，硕士，助理研究员，主要从事基因工程与分子生物学研究。E-mail：gzlr0129@163.com。

通信作者：申刚，硕士，高级农艺师，主要从事特色资源植物研究。E-mail：shengang404@163.com。

[ZK）]

薏苡黑穗病由黑粉菌（Ustilago coicis Brefeld）引起，该病原菌属担子菌亚门黑粉菌目黑粉菌科，易感染、分布广，在大多数国家均有报道[1-2]。随感病薏苡杂交种的推广、连作薏苡的增加，薏苡黑穗病不断蔓延、加重，导致薏苡减产严重。1957、1958年田间调查发现，薏苡黑穗病危害十分严重，大田平均病株率达80%～100%，病瘿率达50%以上[3]。

目前，防治薏苡黑穗病的主要措施有药剂防控、轮作和筛选抗病品种，而通过筛选拮抗菌获得生物菌剂进行生物防治的研究报道相对较少。筛选薏苡黑穗病菌的拮抗菌株一方面可为黑穗病的生物防治提供更多选择，另一方面能降低环境污染，为其他作物黑穗病的防控提供借鉴。笔者采用梯度稀释平板涂布法从土壤中分离并纯化细菌，通过平板对峙法、滤纸片法获得拮抗薏苡黑粉菌的菌株，对薏苡黑穗病有稳定抑菌效果，这为薏苡黑穗病的生物防控提供了技术支撑。

1材料与方法

1.1试验材料

薏苡黑粉菌，由贵州省亚热带作物研究所生化与分子生物学实验室提供。供试土样于2014年7—10月从贵州省兴义市各个县（市）采集，选取薏苡黑穗病发病较重的地块，采集发病植株及健康植株根围的土壤，合计99份，用封口袋密封，贴上标签带回实验室。2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自Tiangen公司；氨苄青霉素，购自Sangon Biotech公司；Ezup柱式基因组DNA 抽提试剂盒（细菌），购自上海生工公司；引物合成和测序由英潍捷基公司完成。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：称取马铃薯200 g，洗净，去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h；纱布过滤，加20 g葡萄糖、14 g琼脂，充分溶解，并补足水；分装，121 ℃灭菌 20 min。营养琼脂培养基（NA，1 000 mL）：牛肉膏3 g，酵母膏1 g，蛋白陈5 g，葡萄糖10 g，pH值7.0；121 ℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1菌株的分离、纯化及保存细菌分离采用稀释涂布法[4]，具体步骤为：称取风干土样10 g，置于盛有90 mL无菌水、带有玻璃珠的三角瓶中，摇床上160 r/min振荡培养 30 min；静置5 min，吸取1 mL悬浮液置于装有9 mL无菌水的试管中，混匀，逐级梯度稀释；取10-4、10-5、10-6 3个梯度的悬浮液0.1 mL于冷却的NA培养基上涂布，每个梯度重复3次，37 ℃恒温培养24 h；挑取菌落形态不一样的单菌落在NA平板上划线，37 ℃培养24 h，连续纯化4次；挑取单菌落于NA斜面上，37 ℃培养24 h，4 ℃冰箱中保存，备用。

1.2.2拮抗菌的筛选

1.2.2.1初筛将5 mm薏苡黑粉菌菌饼接入PDA平板中央，28 ℃恒温培养3 d；采用平板对峙法在距菌饼中央等距离4点处接入细菌分离菌株，以未接细菌处理为对照，28 ℃恒温培养；待对照病原菌长满平板时，观察抑菌效果，记录抑菌圈大小。每处理重复3次。

1.2.2.2复筛将5 mm薏苡黑粉菌菌饼接入PDA平板中央，28 ℃恒温培养3 d；挑取细菌分离物接入NA培养液中，160 r/min 28 ℃摇床培养36 h，即获得细菌发酵液；距菌饼中央等距离对峙3点处放置直径为6 mm的无菌滤纸片，吸取10 μL细菌发酵液于滤纸片上，28 ℃恒温箱内培养，以未接细菌发酵液处理为对照；待对照病原菌长满平板时，观察抑菌效果，记录抑菌圈大小，计算抑制率。每处理重复3次。

1.2.3拮抗菌的鉴定参考《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）、《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》[5-7]，观察平板上单菌落的颜色、气味、透明度、光泽及边缘形状等，革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色，显微镜进行形态观察。对菌株进行甲基红试验（M.R）、吲哚试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐试验、接触酶试验、耐盐性试验及淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、明胶水解试验等生化试验。对菌株进行16S rRNA 序列分析：按照上海生工Ezup 柱式基因组DNA 抽提试剂盒使用说明提取细菌基因组DNA；以基因组DNA为模板，采用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增，扩增产物4 ℃保存。PCR反应体系（50 μL）为：2× Taq PCR MasterMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，加ddH2O补齐至 50 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经连接转化，对阳性转化子进行克隆测序，获得的序列利用DNAStar软件和Blastn程序进行序列比对分析。endprint

1.2.4菌株的发酵条件优化采用单因子变量法对菌株X-2生长的最适温度、最适装液量、最适pH值等生长条件进行优化，以不接菌培养液为对照，测定波长600 nm处的吸光度，以此反映培养菌株X-2的生物量。每试验处理重复3次。种子液的制备：接种菌株X-2接入装有5 mL NA培养基的试管中，30 ℃ 160 r/min振荡培养12 h，即获得种子液。

1.2.4.1培养时间取1 mL种子液（1×108 CFU/mL），接种于30 mL NA培养液中，30 ℃ 160 r/min培养，0～18 h之间每隔2 h取样1次。

1.2.4.2温度取1 mL种子液（1×108 CFU/mL），接种于30 mL NA培养液中，分别置于20、25、30、34、37、40 ℃温度条件、160 r/min振荡培养24 h。

1.2.4.3初始pH值取1 mL种子液（1×108 CFU/mL），分别接种于pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的NA培养液中，30 ℃ 160 r/min振荡培养24 h。

1.2.4.4摇床转速等量接种1.5 mL的种子液（1×108 CFU/mL）于30 mL NA培养液中，分别进行80、100、120、160、180、200 r/min 30 ℃摇瓶振荡培养24 h。

1.2.4.5接种量取振荡培养12 h的种子液（1×108 CFU/mL），分别按体积分数1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的接种量接入30 mL NA培养液中，30 ℃ 160 r/min振荡培养24 h。

1.2.4.6装液量100 mL三角瓶中分别装入10、20、30、40、50 mL NA培养液，灭菌，按3%体积分数接入菌龄为12 h的种子液（1×108 CFU/mL），30 ℃ 160 r/min振荡培养24 h。

2结果与分析

2.1拮抗菌的筛选

结果表明，通过稀释涂布法从土壤中分离并纯化细菌菌株200个；采用平板对峙法初筛到16个对黑粉菌有不同拮抗作用的菌株，依次为X-2、103、22、37、45、46、47、42、4-13、4-6、3-1、3-2、3-3、2-6、2-7、4-5；16个细菌菌株经发酵液滤纸片法复筛发现，16个菌株对黑粉菌均有抑制作用，其中以菌株X-2的抑制率相对最高，为66.7%，具有明显的抑菌带，病原菌菌落边缘与抑菌带接触部位的菌丝发生溶解（图1、图2），这说明菌株X-2对薏苡黑穗病的拮抗作用较强。[FL）]

2.2拮抗菌的鉴定

将菌株X-2接种到NA培养基上进行菌落形态观察，结果表明，菌株X-2的菌落呈白色，圆形，边缘不规则，表面粗[JP3]糙，不透明，不产色素；菌体形态为杆状，大小（0.5～0.6） μm×[JP]（1.6～3.0） μm；产生芽孢，位于菌体中央或偏稍，芽孢形成后菌体不膨大；革兰氏染色为阳性。初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。经生化试验发现，菌株X-2的淀粉、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、明胶、乳糖水解试验及柠檬酸盐试验、接触酶试验、耐盐性试验、甲基红试验（M.R）、吲哚试验为阳性，葡萄糖水解、硝酸盐还原试验为阴性。以菌株X-2基因组DNA为模板，经引物27F、1492R进行PCR扩增和测序，结果表明，菌株X-2的基因片段长度约为948 bp（图3）；经Blast序列分析，亲缘关系相近的前20个序列都为芽孢杆菌属（Bacillus）菌株，菌株X-2与其有99%以上的同源性，其中与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的同源性达到99%。综合形态观察、生理生化特征及16S rRNA基因序列，将菌株X-2鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.3菌株X-2发酵条件的优化

2.3.1培養时间由图4可见，菌株X-2培养0～4 h生长缓慢，为迟缓期；培养4～12 h时生长较为迅速，为对数生长期；培养12～16 h生长趋于平缓，为稳定期；16 h后逐渐减少，菌株X-2进入衰亡期；菌株X-2培养14 h的生长量相对最大。因此，菌株X-2以培养6～14 h的培养液为最适菌株发酵种子。

2.3.2温度由图5可见，20～40 ℃范围内，菌株X-2均能生长；随温度升高，菌株X-2的生物量呈先增加后减少趋势；30～37 ℃时，菌株X-2的生物量相对较大，其中34 ℃时生物量达到最大值。因此，菌株X-2的最适发酵温度为 34 ℃。

2.3.3初始pH值由图6可见，培养液不同初始pH值条件下，菌株X-2的生物量影响不大；pH值为5.0～9.0时菌株X-2均能较好生长；pH值为 6.0时，菌株X-2生长较好且产抑菌物质相对最大，说明该菌的最适生长pH值为6.0。

2.3.4摇床转速由图7可见，随摇床转速的增加，菌株 X-2的生物量呈先增加后减少的趋势；转速为180 r/min时，菌株X-2的生物量相对最大。因此，菌株X-2的最适发酵转速为180 r/min。

2.3.5接种量由图8可见，在一定范围内，菌株X-2的接种量对发酵液的生物量影响不大；接种量为4%时，菌株 X-2的生物量相对最大，接种量大于4%时，菌株X-2的生物量趋于稳定。因此，菌株X-2的最佳接种量为4%。

2.3.6装液量由图9可见，160 r/min转速下，随着三角瓶中装液量的增加，菌株X-2的生物量呈先增加后逐渐减少的趋势；装液量为20 mL时，菌株X-2的生物量相对最大。因此，菌株X-2的最适装液量为20 mL。

3结论与讨论

目前，防治薏苡黑穗病的常用药剂主要有三唑酮、甲基硫

菌灵、多菌灵等。研究多菌灵重复施用后在薏苡仁、土壤中的残留动态及对土壤微生物群落的多样性影响发现，距最后1次施药间隔期21、30 d采样，薏苡仁中多菌灵的残留量为008～0.27 mg/kg，土壤中多菌灵的残留量为ND～1.14 mg/kg，多菌灵对土壤微生物的抑制作用随处理浓度增加而增强[8-9]。20世纪50年代以来，刘颖等从枯草芽孢杆菌培养液中分离出抗真菌肽，并不断发现抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类等抗菌物质[10-12]。从现有植物病害的生防物质看，用于生物防治的微生物有细菌、真菌、病毒等，其中细菌种类相对较多[13-14]，主要有枯草芽孢杆菌、假单胞杆菌、土壤放射杆菌，枯草芽孢杆菌因其具有较强的抗逆性、容易保存等优点而具有巨大的生防潜力和应用前景[15-18]。枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质能溶解病原菌菌丝的细胞壁或细胞膜，造成其原生质外溢、菌丝断裂或畸形，同时可抑制孢子的萌发[16]；或在植物的根部形成一层生物膜，保护植物根部免受病原菌的侵染[19]；或同时分泌多种结构相似的抗菌物质，如菌株B2胞外存在脂肽类抗生素表面活性素、多烯类及一种分子量为564结构未知的新物质这3种抑菌物质，表现出协同的抑菌效果[20-21]。endprint

本研究从土壤中分离得到1个对薏苡黑穗病病原菌有拮抗作用的细菌菌株X-2，结合菌株的形态特征、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析结果，鉴定菌株X-2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其最佳发酵条件为温度34 ℃、pH值6.0、摇床转速180 r/min、接种量4%、100 mL三角瓶装液量20 mL。这与鞠瑞成等的研究结论[22-23]有一定差别，可能与分离的菌株不同有关。另外，虽然从土壤中分离得到了拮抗菌株，但其对薏苡黑穗病的拮抗机制、是否产生抗菌物质等须进行深入研究。

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