2015—2016年度中国甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定

唐静 辛丽 李晓丹 陈永坤 郭俊峰 黄维娟 成艳辉 王大燕 舒跃龙

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

·技术方法·

2015—2016年度中国甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定

唐静 辛丽 李晓丹 陈永坤 郭俊峰 黄维娟 成艳辉 王大燕 舒跃龙

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 卫生部医学病毒和病毒病重点实验室

目的为获得2015—2016年度中国流行的甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株，制备流感病毒重配株并对其进行鉴定。方法采用经典重配的方法，将H1N1亚型流感病毒流行株与H3N2亚型的鸡胚高产重配母本株(X-157株)在鸡胚上进行混合培养。用H3亚型的HA蛋白抗血清和X-157株全病毒抗血清对混合培养病毒进行阴性筛选。阴性筛选后HA滴度较高的病毒用Real-Time PCR法对表面蛋白基因型进行鉴定。对表面蛋白基因型正确的毒株用限制性内切酶酶切鉴定法鉴定其内部基因组成。进一步对HA和NA基因进行Sanger法测序，并用表面基因无氨基酸位点突变的毒株免疫雪貂，进行双向血凝抑制(Two-way hemagglutination inhibition test, HI)试验。结果Real-Time PCR筛选出5株表面蛋白基因型正确的毒株。经内部基因鉴定其中4株为6+2组成，1株为5+3组成。5株重配株的HA和NA基因均未发生氨基酸位点突变。5株重配株HA滴度均维持在1 024以上。最终选取的12号重配株免疫原性良好，HI滴度达5 120，双向HI试验均通过。重配后疫苗株在鸡胚上的产量是重配前野毒株的64倍。结论成功制备了2015—2016年度中国流行的甲型H1N1亚型流感病毒疫苗株，为疫苗贮备和疾病防控奠定了基础。

流感病毒每年暴发流行是全球关注的公共卫生问题[1]。流感病毒根据病毒基质蛋白及核蛋白的抗原性分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，其中甲型流感最常见，在人群中流行的主要为H1、H2、H3甲型流感病毒[2]。

流感病毒表面基因易发生变异,世界卫生组织(World health organization, WHO)每年会基于流行株的播散地理范围及疫苗株对新流行株的保护效果等因素提供当年度的疫苗推荐株[3]。一般情况下，流行株在鸡胚或细胞基质上的复制能力有限，产量较低。A型流感病毒可通过与高产骨架株重配的方法而提高产量[4]。中国尚不具备自主制备季节性流感疫苗株的能力，每年使用的疫苗株为WHO推荐的当年度的北半球季节性流感疫苗株，有时推荐株与中国流行株并不能完全匹配从而降低了疫苗保护效果[5]。2009年之后甲型H1N1流感病毒毒株成为H1N1亚型季节性流感的主要流行株，A/California/7/2009 (H1N1)pdm09类似株是流感疫苗中H1N1亚型组分[6]。2015—2016年度中国流感流行季节分离出的一株甲型H1N1流感病毒在进化树上与疫苗组分不在同一分支。为了获得该株甲型H1N1流感病毒疫苗候选株，作为疫苗储备，本研究利用流感病毒经典重配的方法，制备了2015—2016年度中国甲型H1N1流感疫苗候选株并对其进行鉴定。本研究结果为中国自主研发制备流感疫苗株奠定了基础。

1 材料与方法

1.1主要仪器及试剂Real-Time PCR仪为安捷伦Mx3005P型号，用MxPro软件进行结果分析。PCR仪为Eppendorf Mastercycle型号。凝胶成像仪为Biorad公司GeldocXR型号。Real-Time PCR试剂为AB公司Ag-path One-step RT-PCR kit。RT-PCR试剂为TaKaRa One Step RNA PCR Kit。病毒RNA提取试剂盒为Qiagen公司RNeasy Mini Kit。凝胶回收试剂盒为Qiagen公司QIAquick Gel Extraction Kit。限制性内切酶购自NEB公司。Real-Time PCR引物由上海生工合成。

1.2病毒、抗血清和实验动物甲型H1N1流感病毒A/Shanghai-Putuo/SWL1860/2015(以下简称1860株)由国家流感中心测序鉴定并保存，该病毒接种鸡胚收获的尿囊液的血凝滴度为16。重配母本株NYMC X-157株(以下简称为X-157株，GeneBank序列号： KJ942735)是H3N2亚型重配毒株，其内部基因来自A/PR/8/34(H1N1)病毒，在鸡胚中高产,由英国国家生物制品检定所(National institute for biological standards and control，NIBSC)惠赠。X-157株的全病毒兔抗血清(HI：2560)及其HA蛋白兔抗血清(HI:2560) 由本实验室自制[7]。9～11日龄SPF级鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。6个月龄雌性雪貂购自无锡珊瑚礁生物技术有限公司。1860株全病毒雪貂抗血清(HI:1280)由本实验室自制。

1.3引物设计及Real-TimePCR用Oligo7软件设计Real-Time PCR引物探针，并进行Real-Time PCR。Real-Time PCR反应体系为25 μl：酶1 μl，正反向引物及探针各0.5 μl，模板1 μl，2x PCR Buffer12.5 μl，加去离子水至25 μl。反应条件：45℃10 min,95℃10 min,95℃15 s和60℃45 s，最后2个条件循环40次，并用MxPro软件进行结果分析。Real-Time PCR鉴定HA和NA基因的引物探针序列见表1。

1.4双病毒混合培养及阴性筛选1860株与X-157株按不同稀释度交叉配比混合培养，接种SPF级鸡胚，35 ℃培养48 h。取50 μl病毒鸡胚尿囊液与50 μl X-157株HA蛋白抗血清和50 μl X-157株全病毒抗血清混合室温孵育1 h，然后用1 x PBS溶液调至400 μl，接种2枚SPF鸡胚，每枚鸡胚接种200 μl。经4轮阴性筛选，选择表面基因亚型为H1N1的且血凝滴度最高的12株病毒，用Real-Time PCR法对HA和NA基因亚型进行鉴定。经鉴定为H1N1亚型，且血凝滴度较高的毒株继续进行2轮有限稀释培养。血凝滴度测定和有限稀释培养方法参见[8，9]。

表1 Real-Time PCR表面基因型鉴定引物探针Tab.1 Oligonucleotide Primers used in RT-PCR

注：F:正向;R: 反向

Note:F:Forward; R:Reverse

表3 Real-time PCR 鉴定1860株与X-157株的重配株的表面蛋白基因型Tab.3 Identification of surface protein genes of reassortment strains from 1860 strain and X-157 strain by Real-time PCR method.

Note. ND: Not detected

1.5内部基因鉴定用NEB Cutter在线工具对1860株和X-157株的M、NS、NP、PA、PB1和PB2基因进行分析，选择合适的限制性内切酶。6个内部基因酶切位点设计及内切酶选择如表2所示。

用通用引物将A/Shanghai-Putuo/SWL1860/2015、X-157株和5株重配株的M、NS和NP基因进行全长扩增[9]，PA、PB1和PB2进行部分扩增。扩增后对目的片段进行凝胶回收，酶切，并用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，凝胶成像仪成像。

1.6HA、NA基因测序将鉴定正确的重配株的HA和NA片段送至宝生物公司进行Sanger测序，序列用DNAStar软件进行拼接，用Mega5软件与原始毒株的HA和NA序列进行比对分析，查看有无氨基酸位点突变。

表 2 内部基因片段鉴定用限制性内切酶Tab.2 Restriction Enzymes used for RFLP

1.7重配株雪貂抗血清制备选择一株表面基因无突变的重配株500 μl滴鼻免疫一只6月龄雌性雪貂。免疫2周后收集雪貂血清。雪貂血清与RDE试剂按1∶4比例混合，37 ℃水浴放置18 h去除非特异性因素，56℃30 min破坏补体。

1.8双向血凝抑制试验(Two-wayHemagglutinationinhibitionTest,HI)单向HI试验将鉴定正确的重配株、1860株和X-157株与1860株雪貂血清做HI试验。HI试验按照WHO颁布的流感病毒实验室确认和病原学检测手册[8]。双向HI试验：将最终选定的一株重配株、1860株和X-157株与最终选定重配株的雪貂血清做HI试验。

2 结果

2.1重配株表面蛋白基因型的鉴定为了确定重配株的表面蛋白基因型，本研究设计了Real-Time PCR鉴定体系，引物探针经鉴定，敏感性和特异性良好。对HA滴度最高的12株重配株的表面蛋白基因型进行鉴定，Real-time PCR鉴定结果如表3所示，最终选择了HA基因为H1，NA基因为N1的5株重配株：2号、5号、9号、11号和12号。

表4 重配株内部基因酶切鉴定Tab.4 Identification of internal genes of reassortment viruses

2.2内部基因鉴定对2号、5号、9号、11号和12号重配株的内部基因鉴定用了内切酶方法，对5个重配株内部基因片段进行酶切后，鉴定结果如表4所示：

酶切鉴定结果表明，2号、5号、9号和12号重配株的6个内部基因均来自X-157株，即6+2组成。11号重配株的PB2基因来自1860株，其他片段来自X-157株，即5+3组成。

2.3HA、NA基因序列测定Sanger测序序列比对结果表明，获得的5株重配株其HA和NA基因与其母本毒株序列比较，均未见氨基酸位点的突变。

2.4重配株接种鸡胚后病毒滴度分析为了分析获得的5株重配株其病毒滴度水平，我们将重配株接种鸡胚，获得病毒增殖的尿囊液，对其HA滴度分析表明，均稳定维持在1 024以上，是重配前野毒株的64倍，是现有疫苗组分A/California/7/2009 (H1N1)pdm09(HA滴度：128)的8倍。

2.5双向血凝抑制试验上述5株重配株表面蛋白基因型均是H1N1亚型，HA和NA基因均未发生氨基酸突变，其HA滴度均为1 024。2号、5号、9号和12号重配株内部基因组成均为6+2，11号重配株组成为5+3。随机选择12号重配株开展进一步双向HI实验。双向血凝抑制试验结果显示12号重配株与其对应野毒株抗原性上无差异，双向血凝抑制试验检测通过。

3 讨论

2009年甲型H1N1流感病毒通过人传人途径导致全球大流行，严重威胁全球的公共卫生。至今，甲型H1N1流感依然在世界各地不断发生流行。甲型H1N1流感病毒传染性强、传播速度快，主要通过空气和密切接触传播，同其他甲型流感病毒一样在临床上表现以发热、流涕、咳嗽、头痛为主[10]。

表5 重配株双向HI试验结果Tab.5 Two-way test of reassortment strains

疫苗是预防流感病毒感染及控制疫情扩散的最有效手段[11-15]。流感病毒疫苗株是将流行株与鸡胚高产株共同感染鸡胚后经过一系列筛选得到的具有流行株HA(血凝素)基因和NA(神经氨酸酶)基因，内部基因来自高产株的重配株[16]。2012年以来本实验室一直致力于中国季节性流感疫苗株制备技术平台的建立。通过前期摸索和试验[7,17-18]，初步建立了中国季节性流感疫苗株制备技术平台。本研究利用该平台制备了2015—2016年度中国甲型H1N1亚型重配株。A/Shanghai-Putuo/SWL1860/2 015株重配前HA滴度为16，重配后HA滴度为1024，产量提高了64倍。该重配株与A/California/7/2009 (H1N1)pdm09重配疫苗株(HA滴度为128)相比，产量是其8倍。重配株表面基因通过Real-time PCR、测序鉴定和血清学检测证明重配株HA和NA基因与流行株一致，未发生变异。

在进行表面蛋白基因型鉴定时，从表3可以看出12株重配株利用H3亚型探针鉴定时均未检测到Ct值，而其中7株病毒利用N2亚型探针鉴定时可见检测到33.16～38.63不等的Ct值。可见H3蛋白抗血清能非常有效地进行H3蛋白的阴性筛选，而发挥N2蛋白阴性筛选作用的X-157全病毒抗血清效力相对较差。可能因为全病毒中HA蛋白免疫优势的存在导致NA蛋白免疫原性较弱，因此NA蛋白抗血清效力较差[19-20]。为了在筛选初期得到更多目的重配株，应该制备效力更强的NA蛋白(或成分)抗血清[21-22]。

内部基因鉴定时，由于PA(2 233 nt)、PB1(2 341 nt)和PB2(2 341 nt)基因全长较长，PCR扩增效率较低，因此对这3个基因并未进行全长扩增，而是针对酶切位点位置扩增1 000 nt左右片段。M、NS、PA和PB1基因的酶切位点选在X-157株上。由于X-157株NP和PB2基因PCR产物量较低，酶切后小片段不易观察，因此NP和PB2基因的酶切位点选在1860株上。5株重配株内部基因鉴定结果为有4株为6+2,1株为5+3。本研究成功制备了2015—2016年度中国甲型H1N1亚型流感病毒疫苗候选株，为中国自主研发制备流感疫苗株奠定了基础。

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PreparationandidentificationofinfluenzaH1N1subtypevaccinecandidatestraininChina

TangJing,XinLi,LiXiaodan,ChenYongkun,GuoJunfeng,HuangWeijuan,ChengYanhui,WangDayan,ShuYuelong.

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention;KeyLaboratoryforMedicalVirology,MinistryofHealth,Beijing102206,China

ShuYuelong，Email：ysh@cnic.org.cn

ObjectiveInfluenza H1N1 subtype vaccine candidate strains from a 2015—2016 year epidemic strain in China were prepared and identified by themethod of classical reassortment.MethodsThe influenza H1N1 epidemic strain and H3N2 high-yield reassortant parental strain (X-157) were mixed and inoculated into embryonated chicken eggs by the classical reassortmentmethod . The negative selection of mixed culture virus was carried out with the antiserum of H3 protein and the antiserum of X-157 strain. Real-time PCRmethod was used to test the HA and NA genes. Restriction enzyme digestionmethod was used to identify the internal genes. HA and NA genes of selected strains were sequenced. The strain which HA and NA genes possessed the same amino acid constitution with the wild type virus was selected and immunized to ferret. Two-way test was carried out.ResultsFive strains with expected HA and NA genes were selected by real-time PCR. Internal genes were identified, with 4 strains had 6+2 constitution, 1 strain had 5+3 constitution. Comparing with the wild type virus, HA and NA genes of the 5 strains had no mutation. HA titer of reassortant strains was above 1 024. HI titer of the selected NO.12 reassortment strain reached 5 120, and two-way test was passed. The yield of reassortant strain was 64 times that of the wild type strain.ConclusionsA circulating influenza A (H1N1) strain of influenza A (2015—2016) was successfully prepared in China and laid the foundation for vaccine storage and disease prevention and control.

Influenza A virus；Classical reassortment；H1N1 subtype；Chinese epidemic strain

流感病毒A型；经典重配；H1N1亚型；流行株

2016-11-10)

(本文编辑：陈培莉)

舒跃龙，Email:yshu@cnic.org.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.04.016

重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”-疫苗新型细胞基质、佐剂和免疫递送系统研究(2013ZX10004003)；重大专项“重大新药创造”-流感疫苗应急研发体系能力建设及产品研发(2015ZX09101044)

Fundprograms: Major Projects “Prevention and Treatment of Major Infectious Diseases Such as AIDS and Viral Hepatitis” - Study of New Cell Matrix, Adjuvant and Immune Delivery System (2013ZX10004003).Major Projects “Major New Drug Creation” - Influenza Vaccine Emergency Research and Development System, Capacity Building of Product Research and Development (2015ZX09101044)