不同无核葡萄品种花粉贮藏及其生活力的测定1)

张少伟 李桂荣 朱自果 孙振元

(中国林业科学研究院林业研究所，北京，100091) (河南科技学院) (中国林业科学研究院林业研究所)

不同无核葡萄品种花粉贮藏及其生活力的测定1)

张少伟 李桂荣 朱自果 孙振元

(中国林业科学研究院林业研究所，北京，100091) (河南科技学院) (中国林业科学研究院林业研究所)

以‘京丰无核’ ‘爱神玫瑰’ ‘杨格尔’ ‘奥迪亚无核’和‘奇妙无核’5个葡萄品种的花粉为试验材料，撒播在10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1琼脂的培养基上进行离体培养，研究不同处理方法(液氮未处理、液氮处理)、不同温度(25、0、-20、-40、-80 ℃)、不同贮藏时间(1、3、5 d)对5种葡萄花粉生活力的影响。结果表明：‘爱神玫瑰’的单花药花粉量最多，达到(5 446±80)粒；‘京丰无核’的新鲜花粉生活力最高，为(68.19±2.98)%，‘奇妙无核’的新鲜花粉没有萌发。液氮未处理和处理后观察发现，液氮处理后花粉生活力远远低于液氮未处理的，液氮未处理的同一品种不同处理花粉生活力对比发现，最适宜长期贮藏的温度是-80 ℃，其次是-40 ℃，25、4、-20 ℃条件下贮藏花粉生活力降低较快。不同品种花粉贮藏后，‘京丰无核’花粉萌发率最高，为(55.87±1.14)%，较差的是‘杨格尔’，其花粉萌发率比‘京丰无核’花粉萌发率低17.84%，‘奇妙无核’没有萌发，杂交授粉时，适宜的父本为‘京丰无核’‘爱神玫瑰’与‘奥迪亚无核’。

无核葡萄；花粉；贮藏；生活力；萌发率

杂交育种是无核葡萄选育新品种的主要方法之一[1]。生活力高的花粉是保证植物杂交育种成功的重要前提条件之一。因此，在进行无核葡萄杂交育种工作之前，要先掌握作为父本的特性，特别是花粉的生活力强弱，是选择父本的条件之一[2-3]，花粉离体培养萌发法测定的花粉生活力数据科学可靠，测定结果与真实的花粉生活力接近，这已在许多植物花粉生活力研究中得到验证，是目前杂交育种中花粉生活力测定的首选方法[4-7]。本试验通过研究不同贮藏温度和贮藏时间对不同无核葡萄品种花粉生活力的影响及液氮未处理和液氮处理条件贮藏下葡萄品种花粉生活力的对比，筛选出花粉生活力较高的葡萄品种，为无核葡萄杂交育种选择生活力强的父本材料进行杂交、提高杂交授粉率提供一定的理论支持，对更好地利用这些无核葡萄资源进行生产具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取自中国农业科学院郑州果树研究所葡萄种质资源圃，分别为‘京丰无核’(Vitissp.‘Jingfeng Seedless’)、‘爱神玫瑰’(Vitissp.‘Eggplant’)、‘杨格尔’(Vitissp.‘Youngle’)、‘奥迪亚无核’(Vitissp.‘Otilia Seedless’)和‘奇妙无核’(Vitissp.‘Fantasy Seedless’)[3]。选择生长健壮的植株，于10:00左右随机采下10个发育正常的花序，分别放进自封袋中用冰袋保鲜直接带回实验室。之后用镊子轻轻剥下花药，放在垫有硫酸纸的培养皿中，及时剔除其中的杂质和破裂的花药壁，将培养皿放置在阴凉干燥处，花粉散出后，收集备用。

1.2 仪器设备和试验工具

25 ℃的恒温箱、移液枪、冰箱、电磁炉、电子天平、量缸、载玻片、自封袋、离心管、培养皿、冰袋、泡沫箱、凹玻片、玻璃棒、硫酸纸、镊子、封口膜、标签等。Count star—自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)；10×40 Nikon Ti-s荧光倒置显微镜(上海普赫光电科技有限公司)。

1.3 试验方法

花粉量的测定：取每个品种新鲜花药100粒，放入2 mL的离心管中，将离心管放进烘箱内50 ℃进行散粉，待其散粉后滴入50 g·L-1的六偏磷酸钠溶液至2 mL离心管，混合均匀。然后用1 μL的移液枪将花粉混合液滴入自动细胞计数仪上读取花粉量，每个品种重复3次。

培养基的配置：按照10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1琼脂配制培养基，pH值为6.0，将配制好的培养基倒入干净的凹玻片中，制作发芽床，待凝固后，用玻璃棒蘸取各葡萄品种的新鲜花粉，把花粉均匀地撒播到发芽床上，3个重复，将凹玻片放在垫有湿润滤纸的培养皿中，使发芽床周围湿度保持在90%以上，然后置于恒温箱中25 ℃培养，4 h后观察花粉萌发情况。

花粉处理：将干燥的不同葡萄品种花粉分别装入2 mL离心管内，用封口膜密封瓶口后放入装有无水CaCl2的广口瓶中。液氮未处理分别置于25、4、-20、-40、-80 ℃条件下贮藏；液氮处理分别用锡纸包裹着各葡萄品种花粉折叠严实后放入液氮中处理5 min，然后取出花粉分装到2 mL的离心管中，分别置于4、-20、-40、-80 ℃条件下贮藏。各贮藏条件下的花粉分不同贮藏时间(1、3、5 d)取出，接种在发芽床(10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1琼脂)上进行离体培养，然后置于恒温箱中25 ℃培养，4 h后观察花粉的萌发情况。

1.4 数据分析

培养4 h后，在显微镜下观察花粉萌发情况，以萌发花粉管长度超过花粉粒直径的1/2为萌发花粉，观察统计3个视野内花粉萌发个数并拍照，花粉萌发率=(视野内花粉萌发数/视野内花粉总数)×100%。采用Excel2003和DPS9.50进行数据统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 不同葡萄品种花粉量及新鲜花粉萌发率的比较

由表1可看出，不同葡萄品种花粉量不同，其中‘爱神玫瑰’花粉量最多，为(5 446±80)粒，其次为‘奥迪亚无核’，花粉量为(4 520±79)粒，‘奇妙无核’花粉量最少，仅为(2 895±33)粒，通过方差分析，‘爱神玫瑰’花粉量与‘奥迪亚无核’‘京丰无核’‘奇妙无核’‘杨格尔’的花粉量差异显著(P<0.05)。

表1 不同葡萄品种花粉量及新鲜花粉萌发率的比较

注：表中数据为平均值±标准差；同列中不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

由表1还可以看出，不同葡萄品种新鲜花粉生活力差异明显，测得‘京丰无核’的新鲜花粉生活力最高，为(68.19±2.98)%，其次为‘爱神玫瑰’，花粉生活力为(64.21±3.41)%，‘奇妙无核’花粉生活力最低，为0。‘京丰无核’与‘爱神玫瑰’花粉生活力差异不显著(P>0.05)，与‘奥迪亚无核’‘杨格尔’和‘奇妙无核’差异显著(P<0.05)。由图1可以看出，‘京丰无核’花粉管伸长，花粉萌发;‘奇妙无核’花粉未萌发。

2.2 同一品种不同处理方式花粉生活力的比较

由表2可以看出，同一品种不同贮藏方式处理后测定的花粉生活力差异显著，液氮处理和未处理两种方式同一温度下贮藏1 d的花粉生活力差异明显，液氮未处理的‘京丰无核’花粉在5个温度处理下贮藏后，-80 ℃花粉生活力较高，达到(55.87±1.14)%，而液氮处理后花粉生活力最高的是贮藏在-40 ℃下，生活力为(29.11±0.45)%。其次是‘爱神玫瑰’，液氮未处理的‘爱神玫瑰’花粉在5个温度处理下贮藏后，-80 ℃花粉生活力为(54.81±0.63)%，而液氮处理后花粉生活力最高的是贮藏在-20 ℃下，生活力为(28.35±1.43)%。液氮未处理的‘奥迪亚无核’花粉在5个温度处理下贮藏后，-80 ℃花粉生活力为(53.94±1.25)%，而液氮处理后花粉生活力最高的是贮藏在-80 ℃下，生活力为(28.75±1.54)%。‘奇妙无核’花粉几乎没有萌发，最高的萌发率仅为(3.79±2.23)%。液氮处理后‘京丰无核’ ‘爱神玫瑰’ ‘奥迪亚无核’和‘杨格尔’花粉生活力均没有液氮未处理的高，说明前期用液氮处理无核葡萄的花粉在一定程度上破坏了花粉的活力，液氮处理对于葡萄花粉贮藏是不利的。

a．萌发的‘京丰无核’花粉 b．未萌发的‘奇妙无核’花粉

图1不同葡萄品种新鲜花粉的萌发

表2 同一品种不同处理方式花粉生活力的比较

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

对比液氮未处理的5个温度发现(表2)，贮藏1 d后，测定葡萄花粉生活力，均在-80 ℃温度下花粉生活力较高，‘京丰无核’-80 ℃花粉生活力与-40 ℃花粉生活力差异显著(P<0.05)，和其他温度处理相比差异也显著(P<0.05)；‘爱神玫瑰’-80 ℃花粉生活力与-40 ℃花粉生活力差异不显著(P>0.05)，和其他温度处理相比差异显著(P<0.05)；‘奥迪亚无核’-80 ℃花粉生活力与-40 ℃花粉生活力差异不显著(P>0.05)，和其他温度处理相比差异显著(P<0.05)；‘杨格尔’-80 ℃花粉生活力与-40 ℃花粉生活力差异不显著(P>0.05)，和其他温度处理相比差异显著(P<0.05)，因此，贮藏1 d测定无核葡萄的花粉生活力发现较适宜的贮藏温度是-80 ℃，生活力较高，其次是-40 ℃。常温贮藏花粉和冷藏处理花粉1 d后生活力均较低。

由表2可以看出，液氮处理和未处理两种方式同一温度下贮藏3 d的花粉生活力差异明显，液氮未处理的‘京丰无核’花粉在5个温度处理下贮藏后，-80 ℃花粉生活力较高，达到(43.94±1.87)%；而液氮处理后，贮藏在-20 ℃下的花粉生活力最高，为(28.78±1.62)%。其次是‘爱神玫瑰’，液氮未处理的‘爱神玫瑰’花粉在5个温度处理下贮藏后，-80 ℃花粉生活力为(49.12±1.68)%；而液氮处理后贮藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，为(26.75±2.12)%。液氮未处理的‘奥迪亚无核’花粉在5个温度处理下贮藏后，-80 ℃花粉生活力为(45.51±2.81)%；而液氮处理后贮藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，为(26.24±1.21)%。‘奇妙无核’花粉几乎没有萌发，最高的萌发率仅为(2.95±1.12)%。液氮处理后‘京丰无核’ ‘爱神玫瑰’ ‘奥迪亚无核’和‘杨格尔’花粉生活力均没有液氮未处理的高，贮藏3 d试验结果也同样说明，用液氮处理无核葡萄的花粉对于花粉贮藏是不利的。

对比液氮未处理的5个温度发现，贮藏3 d后测定无核葡萄花粉生活力，均在-80 ℃温度下花粉生活力较高，‘京丰无核’-80 ℃花粉生活力与-40 ℃花粉生活力差异不显著(P>0.05)，和其他温度处理相比差异显著(P<0.05)；‘爱神玫瑰’-80 ℃花粉生活力与-40 ℃花粉生活力差异显著(P<0.05)，和其他温度处理相比差异也显著(P<0.05)；‘奥迪亚无核’-80 ℃花粉生活力 与-40 ℃花粉生活力差异不显著(P>0.05)，和其他温度处理相比差异显著(P<0.05)；‘杨格尔’-80 ℃花粉生活力与-40 ℃花粉生活力差异不显著(P>0.05)，和其他温度处理相比差异显著(P<0.05)，因此，贮藏3 d测定花粉生活力结果同样表明，无核葡萄较适宜的贮藏温度是-80 ℃，其次是-40 ℃。

由表2可以看出，液氮处理和未处理两种方式同一温度下贮藏5 d的花粉生活力差异明显，液氮未处理的‘京丰无核’花粉在贮藏-80 ℃下花粉生活力较高，达到(38.47±2.07)%，而液氮处理后在贮藏-40 ℃下的花粉生活力最高，为(20.52±0.94)%。其次是‘爱神玫瑰’，液氮未处理的‘爱神玫瑰’花粉在贮藏-80 ℃下的花粉生活力为(42.80±1.43)%，而液氮处理后贮藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，为(22.35±2.75)%。液氮未处理的‘奥迪亚无核’花粉在贮藏-80 ℃下的花粉生活力为(43.05±2.02)%，而液氮处理后贮藏在-80 ℃下的花粉生活力最高，为(23.53±0.52)%。‘奇妙无核’花粉几乎没有萌发，最高的萌发率仅为(2.01±1.30)%。液氮处理后‘京丰无核’ ‘爱神玫瑰’ ‘奥迪亚无核’和‘杨格尔’花粉生活力均没有液氮未处理的高，贮藏5 d的试验结果也同样说明，用液氮处理无核葡萄的花粉对于花粉贮藏是不利的。

对比液氮未处理的5个温度发现，贮藏5 d后测定无核葡萄花粉生活力，均在-80 ℃温度下花粉生活力较高，‘京丰无核’-80 ℃花粉生活力与其他温度处理相比差异均显著(P<0.05)；‘爱神玫瑰’-80 ℃花粉生活力与其他温度处理相比差异均显著(P<0.05)；‘奥迪亚无核’-80 ℃花粉生活力与其他温度处理相比差异均显著(P<0.05)；‘杨格尔’-80 ℃花粉生活力与其他温度处理相比差异均显著(P<0.05)，因此，贮藏5 d测定花粉生活力结果表明，无核葡萄较适宜的贮藏温度是-80 ℃。其他温度贮藏花粉生活力随着贮藏时间的延长，生活力逐渐下降，而-80 ℃下贮藏的花粉生活力3 d和5 d的差异不显著，说明-80 ℃下贮藏葡萄花粉，可以保持其生活力，对于长时间贮藏葡萄花粉是个适宜的温度，对于杂交授粉采集花粉贮存、异地授粉花粉的收集贮存、不同花期父母本杂交授粉花粉的长期贮藏利用及花粉的研究等方面具有一定的实用指导价值。

通过前面的对比研究，液氮未处理的花粉生活力普遍高于液氮处理的，因此，选择液氮处理方式下花粉生活力，对比不同品种花粉生活力的强弱，选择适宜的无核品种作为无核葡萄育种父本亲本材料。

另外，通过表2还可以看出，不同温度处理贮藏不同时间后，‘京丰无核’‘爱神玫瑰’‘奥迪亚无核’花粉生活力均较高，最高的是‘京丰无核’，花粉生活力达到了(55.87±1.14)%，‘杨格尔’生活力较差，同一处理下与‘京丰无核’相比，花粉萌发率相差最高的达到17.84%，生活力最差的是‘奇妙无核’，几乎没有萌发。因此，选择无核葡萄作为父本亲本时，优先考虑‘京丰无核’‘爱神玫瑰’‘奥迪亚无核’。

3 结论与讨论

无核葡萄新品种的获得主要是通过杂交授粉育种技术获得，选择无核葡萄作为父本进行杂交授粉，可以提高无核后代获得率，选择适宜的亲本和确定杂交组合，是杂交育种研究工作中非常重要的一环。作为父本亲本的选择，需要了解其花粉量和花粉生活力的强弱，花粉量大和花粉生活力强的父本是保证授粉的一个重要条件，研究不同无核葡萄花粉的特性，对于父本的选择具有指导意义[4-5]。

很多人在花粉特性方面开展的研究侧重于花粉形态的研究[8-10]，对于花粉活力有一定的参考价值，如显微观察的花粉形态干瘪变形，说明生活力降低或者失活。杨晓平等[11]研究认为，授粉品种花粉数量的多少和花粉质量的好坏直接影响杂交的座果率和产量，采用血球计数板法测定了23个砂梨栽培品种的花粉量，发现有些品种花药里就没有花粉，直接判定其不能作为杂交授粉的父本，是杂交育种工作的前提，本试验测得‘奇妙无核’花粉量最少，结合后期花粉生活力的测定发现其生活力也最差，因此，测定父本花粉量也可以作为了解其生活力的一个参考指标。

而葡萄杂交授粉前，如果了解到双亲的花期早晚相差很远，可以贮藏花粉调节花期，而贮藏后的花粉必须保证其生活力，才能保证后期杂交授粉工作的成功，所以适宜的贮藏条件是保证花粉生活力强弱的首要保证，说明花粉生活力的强弱，一方面受到遗传因素决定，另外一方面受到环境因素的影响，干燥、低温可以较好地保持花粉生活力，适宜的条件才能保证长时间的贮藏花粉，以供不同杂交组合和不同时期的杂交育种[12-13]。杜克兵等[14]将贮藏的杨树花粉应用于隔年杂交授粉，结果表明，花粉贮藏可以打破杂交亲本的时间和空间隔离，扩大杂交育种的范围。本试验主要研究了无核葡萄花粉不同贮藏条件后生活力的变化，选用的是离体萌发法测定其生活力，本试验是在研究‘火焰无核’葡萄花粉萌发和花粉管生长的作用中，获得适宜‘火焰无核’葡萄花粉离体萌发的培养基为蔗糖250 g·L-1+硼酸0.08 g·L-1+硝酸钙0.05 g·L-1，萌发率为22.22%，萌发率偏低[15]，不断通过预试验获得了无核葡萄离体培养效果较适宜的培养基(10%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+6 g·L-1琼脂)，培养获得的葡萄新鲜花粉生活力最高的达到(68.19±2.98)%。刘佳等[16]在研究‘巨玫瑰’花粉生活力时，对花粉3个发育阶段、2种干燥方式的生活力进行测定，侧重于材料的选择处理，而本试验选择的是不同品种成熟的花粉，不同的贮藏方式，研究其花粉生活力，在花粉发育的不同阶段没有开展相关研究，对其贮藏前采用液氮进行了处理，结果发现，液氮未处理的效果较佳，液氮处理花粉对其生活力的影响原因还需进一步开展相关研究。本试验研究发现，液氮未处理贮藏5个品种花粉生活力差异较大，较适宜做父本的材料为‘京丰无核’ ‘爱神玫瑰’‘奥迪亚无核’。Mustafa et al.[17]研究了‘burdur dimditi’等7个葡萄品种的花粉量、生活力及萌发率，获得了花粉量最高的品种为‘burdur dimditi’，为9 000粒，离体培养花粉较适宜的培养基为15%蔗糖+10 mg·L-1硼酸+10 g·L-1琼脂，不同品种花粉生活力不同(31.5%～68.8%)，无核葡萄育种工作中杂交授粉是一项长期而艰难的工作，开展大量的杂交授粉，获得尽可能多的杂交果穗，工作量大，操作困难，一般杂交座果率低，葡萄育种因此受到限制。选择合适的母本和父本，确定最佳杂交组合，可以提高无核葡萄杂交组合的座果率，也是获得大量杂交后代的基础，因此,利用离体培养花粉技术及田间相应技术，如何应用辅助提高花粉在柱头上的萌发率，提高田间杂交授粉率有待于进一步研究[4-5，18-19]。

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PollenStorageConditionandViabilityofDifferentSeedlessGrapeCultivars//

Zhang Shaowei
(Research Institute of Forestry, CAF, Beijing 100091, P. R. China);
Li Guirong, Zhu Ziguo
(Henan Institute of Science and Technology);
Sun Zhenyuan
(Research Institute of Forestry, CAF)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：49-53.

Seedless grapes; Pollen; Storage condition; Viability; Germination rate

S663.1；Q943.1

1)国家自然科学基金项目(U1404321)、河南省科技计划项目(152300410094)、河南省高等学校重点科研项目计划(16A210003)。

张少伟，男，1981年10月生，中国林业科学研究院林业研究所，博士研究生；现工作于河南农业职业学院园艺园林学院，讲师。E-mail:hncazsw@126.com。

孙振元，中国林业科学研究院林业研究所，研究员。E-mail:sunzy@263.net。

2017年6月14日。

责任编辑：任 俐。

With the pollen of five grapes of Jingfeng Seedless, Eggplant, Youngle, Otilia Seedless and Fantasy Seedless, and the medium of 10% sucrose+10 mg·L-1boric acid+6 g·L-1agar, we studied the effects of different treatment conditions (Liquid nitrogen treatment， or not), different temperature (25 ℃, 0 ℃, -20 ℃, -40 ℃, -80 ℃) and different storage time (1, 3, 5 d) on the pollen viability. The pollen amount of the single anther of Eggplant was 5 446±80, it was the largest number. The highest fresh pollen viability was Jingfeng Seedless of (68.19±2.98)%. The fresh pollen viability of Fantasy Seedless was the lowest, it could not germinate. Before all these pollens were storied, they were treated by liquid nitrogen or not, the effect of no liquid nitrogen was better. Under the condition of no liquid nitrogen, -80 ℃ was the most appropriate storage temperature. The better appropriate storage temperature was -40 ℃. A large difference was among different grape cultivars. Jingfeng Seedless pollen germination rate was the largest of (55.87±1.14)%, and Youngle pollen germination rate was the smallest. These suitable male parents were Jingfeng Seedless, Eggplant and Otilia Seedless.