野生绵枣儿的花粉活力与柱头可授性1)

高文杰 王欢 王想 王霁佳 宫明雪 崔兰明 何淼

(东北林业大学，哈尔滨,150040)

野生绵枣儿的花粉活力与柱头可授性1)

高文杰 王欢 王想 王霁佳 宫明雪 崔兰明 何淼

(东北林业大学，哈尔滨,150040)

以引种的野生绵枣儿(Scillascilloides)为研究对象，对其进行花粉和柱头形态观察、花粉活力检测方法的筛选，同时研究了花粉活力和柱头可授性，探讨了两者与授粉成功的关系。结果表明：绵枣儿花药暴露于空气中20～40 min便开始开裂，花粉为单粒花粉，有1个萌发沟。最适花粉萌发培养液成分为ME3+10 g·L-1蔗糖+0.3 g·L-1硼酸+0.2 g·L-1硝酸钙，始花期与盛花期的花粉活力在80%左右，末花期仅为20%左右。花粉在4 ℃条件下存活时间约为3 d，25 ℃条件下存活时间为2 d，而在35 ℃条件下存活时间只有1 d。柱头在散粉前就已经具备可授性，在开花后1～2 d可授性最强。有效花粉与柱头可有1 d的相遇期，但相遇期内柱头可授性不是很强，为异花传粉提供了机会。

绵枣儿；花粉形态；花粉活力；柱头可授性

绵枣儿(Scillascilloides)为百合科(Liliaceae)绵枣儿属(ScillaL.)多年生草本植物，又名地枣、黏枣、天蒜等[1]。绵枣儿在我国分布范围广泛，东北地区多野生于海拔2 600 m以下的山坡、草地、路旁或林缘[2]。其花色艳丽，花期长，耐寒、耐旱性强，生长季节不需要特殊管理，病虫害较少，是一种极具发展、应用潜力的野生花卉。绵枣儿有固土的作用，且具有一定的生态效益，可在花境、林间草地、坡地群植，也可以三五株成丛点缀在山石旁，也可作为切花应用，是良好的花境、花坛和切花素材，与其他园林景观植物配合，可营造出与众不同的季相景观[3]。目前，关于绵枣儿的研究主要集中在药理成分[4-5]、细胞学分析[6-7]、无性繁殖[8-9]、抗旱性[10]等方面。为更充分地开发绵枣儿野生花卉资源，将其广泛的应用于东北寒冷地区园林绿化，对其进行生长情况的跟踪观察，认识整个开花过程的自然规律及有性繁殖特性是十分必要的。

传粉是植物有性生殖不可缺少的环节[11]。有花植物的传粉过程可以大致分为三个步骤：花药释放花粉；花粉由花药(父系结构)传送到柱头(母系结构)；花粉成功落于柱头上，相互识别，并萌发花粉管[12]。在传粉过程中，花粉活力的有无和柱头是否具有可授性是植物生殖成功的关键因素[13]。目前，人们对传粉生物学的认知不仅局限于传粉现象，对于传粉的载体花粉和柱头的研究也逐渐重视[14-16]。但关于绵枣儿花粉活力及柱头可授性等相关基础研究未见报道。为此，本试验对绵枣儿的花部特征、花部微观结构、花粉活力、柱头可授性等方面进行研究，为进一步完善绵枣儿的繁殖发育体系打基础，为后期绵枣儿在北方高寒地区的合理应用提供技术支持。

1 材料与方法

本试验以2014年从吉林省磐石市烟筒山镇(126°1′E，43°18″N)引种至东北林业大学园林学院苗圃的400余株3～5年生的绵枣儿植株为研究对象。

花粉及柱头综合特征观察:在绵枣儿花蕾期，随机选取15株植物，每株选6朵花进行挂牌标记。开花前每天观察1次。开花当天和第2天每隔2 h观察记录一次，观察时间为07:00—17:00。随后每天观察1次，直至花朵座果。记录开花动态过程及各部分器官发生变化的时间，注意花粉散出、花柱弯曲的情况。

花粉及柱头亚显微特征观察:在绵枣儿盛花期采集新鲜花朵，清洁表面，用毛笔扫取花粉进行制样，观察单个花粉的结构，将柱头切割摆放成不同角度制样，通过粘贴、喷金等处理后置于日立S-520扫描电镜下观察拍照。

花粉活力测定方法的筛选:将盛花期混合均匀的绵枣儿花粉，分别采用TTC染色法[17]、I2-KI染色法[18]和离体萌发法[18]进行花粉萌发试验，测定花粉活力，并筛选出最适宜的测定方法。离体萌发法选用的培养液为10 g·L-1蔗糖+0.05 g·L-1硼酸+0.10 g·L-1Ca(NO3)2。

花粉离体萌发最适培养液的筛选:以ME3为基础培养液，通过3因素3水平L9(34)正交试验确定最适宜花粉萌发培养液，蔗糖、H3BO4、Ca(NO3)2为3因素，具体用量见表1。本试验共9个处理，每个处理进行3次重复。根据试验的最终结果确定培养液各组成成分的用量。

表1 L9(34)正交设计的因素和水平

花粉活力及花粉寿命检测：分别采取种群始花期、盛花期、末花期的花朵，取花粉置于最适培养液中培养，在25 ℃恒温箱中黑暗培养2 h。每个处理3次重复，统计视野中萌发花粉所占的百分比。花粉管长度大于花粉直径即视为萌发，记录每个视野中花粉总数和萌发花粉数，按以下公式计算萌发率：

花粉保存方法检测：采集盛花期的绵枣儿花粉室温干燥2 h，分别放在4、25(室温)、30 ℃条件下保存，每天测定其花粉活力。

柱头可授性的测定：观察花朵开放过程中柱头分泌黏液的情况，并采用联苯胺—过氧化氢测定柱头的可授性情况[19]。开花前1 d开始采集单花柱头，在凹玻片中滴1滴联苯胺—过氧化氢反应液(V(1%联苯胺)∶V(3%过氧化氢)∶V(水)=4∶11∶22)，将柱头浸入反应液中，置于显微镜下观察。若柱头周围呈现蓝色或紫黑色的大量气泡，则柱头具有可授性。每个时期采集15朵单花，并记录检测结果。

2 结果与分析

2.1 绵枣儿雄蕊及柱头的形态特征

2.1.1 开花过程中绵枣儿雄蕊及柱头的形态变化

绵枣儿为顶生总状花序，每个花序具有小花40～300朵不等。花朵开放时，花瓣淡紫红色，在开花前1～2 h花蕾开始松动，当日即可完成开花，柱头略低于花药或与花药高度持平，部分柱头在开花前2 h就已经具备微弱的可授性，随时间增加，黏液分泌量增加，可授性增强。花朵在开放的过程中，柱头伸长，且花丝的开展角度增加，花药在花被片完全打开后逐渐开裂，无先后次序，花药暴露于空气中20～40 min便开始开裂，6枚花药完全开裂需要1～2 h，当天基本可以完成散粉。

2.1.2 绵枣儿花粉及柱头的亚显微特征

绵枣儿花药开裂后，花粉散出，可见花粉为单粒，长球形(图1A)。极面观为近圆形，赤道面观为舟形(图1B)。花粉粒大小约为48.75 μm×20.48 μm。按照Erdtman的划分标准，属于中孢粉。萌发器官为单沟，萌发沟宽而浅，长至两端(图1A、B)。花粉外壁光滑，具有不规则的小孔，小孔分布较均匀。绵枣儿柱头的形态和结构满足了虫媒传粉的要求，柱头相对表面积较大，表面为许多球状凸起(图1C)。柱头成熟时有黏液出现，柱头伸长，可以粘附和嵌入花粉(图1D)。

2.2 绵枣儿花粉活力测定方法的确定

经过试验发现，TTC和I2-KI染色法用于检测绵枣儿的花粉活力效果不明显，由于绵枣儿花粉本身为黄色，经染色后，花粉深浅不一，难以界定花粉是否具有活力，而离体萌发法可以明显看到萌发的花粉管，便于判断和统计。因此，离体萌发法是检测绵枣儿花粉活力的最佳方法。

通过正交试验，综合不同配比培养液的花粉萌发结果，分析蔗糖、H3BO3和Ca(NO3)2对绵枣儿花粉萌发的影响。不同蔗糖水平可以显著影响绵枣儿花粉的萌发率(p<0.05)，其中10 g·L-1水平下的花粉萌发率最高，为68.87%(表2)。而H3BO3和Ca(NO3)2对花粉萌发率的影响未达到显著性水平，其中H2硼酸和C3水平萌发率较高。因此，确定绵枣儿花粉萌发的最适培养液为S2H2C3，即10 g·L-1蔗糖+0.3 g·L-1H3BO3+0.20 g·L-1Ca(NO3)2。通过极差计算发现(表3)，3者对绵枣儿花粉萌发率有不同程度的影响，其中蔗糖最大，硼酸次之，硝酸钙的影响最小。

A、B.花粉形态；C.柱头形态；D.花粉与柱头接触授粉；PG.花粉；PD.萌发沟；Sti.柱头；SP.乳突。

表2 不同蔗糖、H3BO3、Ca(NO3)2水平对花粉萌发率的影响

表3不同蔗糖、H3BO3、Ca(NO3)2水平下花粉萌发率的显著性分析

方差来源偏差平方和自由度F值显著性S6651．445261．428显 著H204．77220．091不显著C78．17220．034不显著

2.3 绵枣儿花粉活力及花粉寿命检测结果

通过对2015、2016年不同花期花粉活力进行测定，发现两年试验结果相近(表4)，始花期时花粉活力已经可以达到75%左右，盛花期时花粉活力最高，接近90%，盛花期后花粉活力逐渐下降，到末花期时，花粉活力仅为20%左右。

表4 不同花期绵枣儿花粉活力

注：表中数据为平均值±标准差。

2.4 绵枣儿花粉保存方法检测结果

若花粉萌发率低于5%，判定花粉失活，那么绵枣儿花粉在4 ℃条件下可保存3 d，在室温下可保存2 d，而在35 ℃条件下只能存活1 d(表5)。这是因为花粉在高温、高氧条件下，酶活性衰退速度、花粉代谢活动、有害物质积累等都加快，从而加速了花粉的死亡。

表5 不同温度处理下绵枣儿的花粉活力

注：表中数据为平均值±标准差。

2.5 绵枣儿柱头可授性检测结果

通过联苯胺—过氧化氢法检测绵枣儿柱头可授性，结果发现(表6)，绵枣儿在开放前2 h部分柱头已经具备可授性，开放1～12 h柱头具有可授性但是可授性较弱，开花12 h以后，随着柱头黏液分泌量的增加，柱头可授性达到最强，开花第3天开始，柱头可授性减弱，到开花第4天只有部分柱头具有可授性，此时单花开始萎蔫。

表6 绵枣儿柱头可授性检测结果

注：-表示柱头不具备可授性；-/+表示部分柱头具备可授性；+表示柱头具备可授性；++表示柱头可授性较强；+++表示柱头可授性最强；-1 d表示开花前1 d；-2 h表示开花前2 h。

3 结论与讨论

花粉是植物的雄性生殖细胞,担负着植物传种的任务,拥有植物发育所需要的全部营养物质[20-22]。风媒植物花粉质轻、干燥，通常具有气囊，柱头一般无阻碍的裸露在外，雌蕊较长[23]。而绵枣儿花粉较大，不具备气囊，同时柱头基本与花药高度持平。综合以上特征，绵枣儿花粉及柱头的结构特征符合虫媒花的特点，为虫媒植物。花粉具有活力是完成受精的必要条件，因此，准确测定花粉活力非常重要。快速检测花粉活力的两种方法为染色法与萌发法，本研究中用TTC和I2-KI染色法检测绵枣儿的花粉活力时，染色后花粉颜色深浅不一，难以界定其是否具有活力，这可能是由绵枣儿花粉壁的薄厚、花粉外壁的组织物质和花粉内各种酶活性的强弱等因素所导致的[24-25]。类似研究也表明，TTC染色法不适合老鸦瓣[26]、腊梅[27]、桂花[28]等植物花粉活力的测定。而花粉萌发法测定的数据科学可靠，并可完全定量，几乎适用于所有植物，因此，本研究选定花粉萌发法进行绵枣儿花粉生活力的测定。

柱头可授期是花朵成熟过程中的一个重要时期，其很大程度上会影响自花传粉率、开花后不同阶段的传粉率、各种传粉者的相对重要性、雄性和雌性功能之间的相互干扰、不同基因型花粉之间的竞争以及配子体选择的机会等[29]。通过观察发现，绵枣儿散粉前及散粉期柱头较短，高度低于或与花药持平，扫描电镜下显示，柱头顶端具有乳突细胞，在联苯胺—过氧化氢反应液下显示具有可授性，但程度不高。开花后12 h至第2天，柱头明显伸长，可见乳突细胞大量增加，柱头分泌黏液量也达到最大，经测定此时可授性最强，可授期可维持4 d左右。但绵枣儿花药开花当天即可基本完成散粉，花粉活性较高，因此，有效花粉与柱头可有1 d的相遇期，但相遇期内柱头可授性不是很强，开花12 h后柱头可授性达到最高，在一定程度上影响了授粉成功的可能性，花粉和柱头在出现时间上的不同步是一种较为常见的限制自花传粉的机制[30-31]，因此，判定绵枣儿属于异花传粉植物。

绵枣儿花粉的最适培养液成分为ME3+10 g·L-1蔗糖+0.3 g·L-1硼酸+0.20 g·L-1硝酸钙，始花期与盛花期的花粉活力在80%左右，末花期仅剩20%左右，绵枣儿当日散粉，花粉活力较高，柱头在散粉前后就已经具备可授性，因此认为雌雄同熟。绵枣儿花粉的最适保存温度是4 ℃，可保存3 d。柱头在开花后1～2 d可授性最强，可授期可维持4 d左右。因花粉散完后柱头才达到最强可授期，这为异花授粉提供了很大的机会。

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PollenViabilityandStigmaReceptivityofScillascilloides//

Gao Wenjie, Wang Huan, Wang Xiang, Wang Jijia, Gong Mingxue, Cui Lanming, He Miao
(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：45-48,61.

Scillascilloides； Pollen morphology； Pollen viability； Stigma receptivity

S682.3;Q945.53

1)中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572017CA13)。

高文杰，女，1990年6月生，东北林业大学园林学院，博士研究生。E-mail：wenjie_gao0724@163.com。

何淼，东北林业大学园林学院，副教授。E-mail：hemiao@nefu.edu.cn。

2017年3月23日。

责任编辑：任 俐。

The experiment was conducted to study pollen and stigma morphology, pollen viability and stigma receptivity ofScillascilloidesin Changbai Mountains, China. The relationships between pollen viability, stigma receptivity and pollination success were also analyzed. The anther ofScillascilloidesstarted cracking when exposed in air after 20 to 40 min.S.scilloideswas single pollen with one germination ditch. The best medium for pollen germination was ME3+10 g·L-1Sucrose+0.3 g·L-1H3BO4+0.2 g·L-1Ca(NO3)2. Pollen viability was about 80% at initial time of florescence and the full flowering period, but the value was only about 20% at the end of florescence. Survival time of pollen is 3 d at 4 ℃. The value is 2 d at 25 ℃, and 1 d at 35 ℃. Stigma had receptivity ability before anthers loose powder and stigma receptivity was strongest after flowering 1-2 d. Effective pollen and stigma can have 1-d meeting period, but during the period of stigma receptivity is not very strong which provides the opportunity for cross-pollination.