绵头雪莲花提取物对UVA照射后人成纤维细胞增殖的影响

郑博文 阮光洪 尼玛此里 鲁茸达瓦 瞿红叶黄相中 李 冰 陈文雄 夏玉洁 邓丹琪

绵头雪莲花提取物对UVA照射后人成纤维细胞增殖的影响

郑博文1，6阮光洪1尼玛此里2鲁茸达瓦2瞿红叶3黄相中4李 冰5陈文雄5夏玉洁5邓丹琪6

目的： 明确绵头雪莲花提取物对UVA照射下的人成纤维细胞的保护作用。方法： 制备绵头雪莲花浸膏，将培养的人成纤维细胞分为正常对照组、UVA照射组(10 J/cm2)及UVA+药物组，CCK8法检测细胞增殖活性，并比较各组吸光度值。结果： UVA+药物组漂浮死细胞(低于5%)少于UVA照射组(约20%～30%)；UVA+药物组(200 μg/mL)吸光度值为1.16±0.22，高于UVA照射组的0.5±0.12，差异有统计学意义(P<0.05)。结论： 绵头雪莲花提取物对UVA照射人成纤维细胞具有一定的保护作用。

绵头雪莲花； 紫外线； UVA; 人成纤维细胞

人的皮肤是一个把内在器官和外部环境隔离的重要屏障[1]，人类皮肤老化的原因包括自然老化、压力、环境和遗传，但是最有害的因素是阳光(紫外线)和由此产生的氧化应激[1]。紫外线分为UVA(长波紫外线，波长320～400 nm)、UVB(中波紫外线，波长290～320 nm)、UVC(短波紫外线，波长100～290 nm)，但是几乎全部的UVC和90%的UVB被大气中的臭氧层吸收，能够到达地面的UV主要为UVA和少量UVB[3-5]。雪莲花是一种自古被中国藏族、维吾尔族广泛使用的草药，现代研究证明雪莲花具有抗炎、抗辐射等药物功效，而且以绵头雪莲花作用最强[6]。但是，雪莲花是否有抗皮肤光老化、光损伤的作用目前尚未见相关研究报道。本研究旨在观察绵头雪莲花提取物对紫外线照射后人成纤维细胞的保护作用。

1 材料

1.1 实验动物 人成纤维细胞，购于中科院昆明动物所细胞库。

1.2 测试物 绵头雪莲花植物全柱，由云南省迪庆州德钦县人民医院藏医科协助收购；绵头雪莲花提取物(浸膏)，由云南民族大学民族医药学院民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室协助提取。

1.3 紫外线照射设备 SH-4A(UVA)，UVA型辐照剂，上海西格玛高技术有限公司生产；自制紫外线照射仪高度调节架。

1.4 主要试剂 Gibco小牛血清、DMEM高糖培养基：赛默飞公司；0.25%胰蛋白酶：北京索莱宝公司；CCK8试剂盒：上海七海复泰生物科技有限公司。

2 方法

2.1 人成纤维细胞培养

2.1.1 倒置显微镜下观察细胞状态。细胞长到80%以上，状态好活力高，视野基本无死细胞及细胞碎片，颗粒无或很少。

2.1.2 弃培养液，加入2 mL PBS清洗细胞层，洗去残余血清，弃PBS，再重复洗一次，并用巴氏吸管吸净残余的PBS，加入1 mL胰酶-EDTA消化，翻转后，放入培养箱中大约2 min，然后水平摇晃使胰酶-EDTA覆盖细胞层，在显微镜下动态观察细胞消化情况(细胞圆缩，轻敲细胞瓶时细胞脱落即止)；加入2 mL新鲜培养基终止消化，将瓶底细胞吹打下来后，充分吹打细胞液，使其成为单细胞悬液，转移至15 mL离心管中。

2.1.3 使用1000 rpm离心5 min，离心完毕后弃掉上清液，并加入6.5 mL新鲜培养基混悬。

2.1.4 吸取一定量新鲜培养基到干净的加样槽中，用排枪向调0孔和边缘孔每孔加100 μL培养基，再吸取配好的细胞液到另外的加样槽中，每个实验孔加100 μL细胞液。

2.1.5 将种好的细胞板入CO2培养箱培养，37℃，5% CO2，培养过夜。

2.2 实验条件摸索确立

2.2.1 雪莲花提取物对人成纤维细胞细胞毒性试验 取一块完成种板的96孔，配制系列不同浓度雪莲花提取物PBS溶液，每孔加入受试物20 μL详见表1。CO2培养箱培养，37℃，5% CO2，培养18 h后，进行cck8细胞活性检测吸光度，并使用公式计算细胞活力=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] 。人成纤维细胞活力大于0.9的加药组剂量作为后续正式检测的雪莲花高剂量组剂量。

测得吸光度计算细胞活力见表2，选择200 μg/mL为正式实验的高剂量组剂量。

2.2.2 紫外光细胞毒性试验 在同一块96孔，长波紫外线组距离紫外线灯5 cm，测得紫外线强度10 mw/cm2，测试组分别照射17、34、51、60 min， 以达到10 J/cm2、20 J/cm2、30 J/cm2、36 J/cm2的不同照射剂量；对照组及其余不照射的用锡箔纸遮盖。照射后在37℃培养箱中继续培养18 h后进行CCK8检测吸光度并依据上述公式计算细胞活性。细胞活性在50%左右的照射剂量确定为正式实验的照射剂量。

测得吸光度及计算细胞活力，见表3，选取10 J/cm2为正式实验的照射剂量。

2.3 正式实验分组及加药 取一块完成种板的96孔，配制系列高、中、低浓度的绵头雪莲花提取物-PBS溶液，每孔加入受试物20 μL见表4。

表1 各药物浓度组和对照组加入药物情况

注：空白调零孔为未接种细胞的空白孔，只加入100 μL细胞培养基；正常对照为接种细胞不加任何干预因素的对照孔

表2 各药物浓度组和对照组测得的平均吸光度数值及计算得到的细胞活力值

表3 各紫外线剂量组和对照组测得的平均吸光度值及计算得到的细胞活力值

表4 各实验组加入药物情况

2.4 紫外光照射 所有实验组加药物放入37℃培养箱继续培养3 h后，除对照组外均用测定为10 mw/cm2强度紫外线剂量照射17 min，累计剂量大约为10 J/cm2，照射后在37℃培养箱中继续培养18 h。

2.5 cck8细胞活性检测 完成步骤4后，倾去96孔板培养液并拍干，配制含10% cck8检测试剂的细胞培养液，每孔加入100 μL，37℃培养箱内孵育1～4 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

2.6 统计学方法 所测得采用吸光度使用SPSS 17软件进行统计分析，若各组数据均值呈正态分布且方差齐用ANOVA分析各组参数，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 外观形态改变 正常人成纤维细胞呈长梭形，细胞排列紧密，无或很少见漂浮死细胞(在全部细胞中所占比例低于1%)和颗粒(图1)；UVA照射对照组人成纤维细胞经过紫外线照射后细胞密度明显降低，连接松散，呈椭圆形、长圆形，可见大量漂浮死细胞(在全部细胞中所占比例约20%～30%)和颗粒样物(图2)；加入各浓度梯度的绵头雪莲花提取物的成纤维细胞密度比UVA照射对照组明显增高，仍有部分细胞变圆，局部连接松散，可见少量漂浮死细胞(在全部细胞中所占比例低于5%)和颗粒样物(图3)。

3.2 细胞活力改变 各组细胞测得吸光度见表5，从表中我们可以看到UVA照射对照组较正常对照组及绵头雪莲花各浓度组吸光度均明显下降，应用SPSS 17.0进行ANOVA分析，差异有统计学意义(F=39.15,P<0.05)；正常对照组吸光度高于各剂量浓度组，但与高剂量组、中剂量组差异无显著性(P>0.05)，与低剂量组差异有显著性(P=0.02)；各剂量组从高到底，吸光度依次下降，但差异无显著性(P>0.05)(图4)。

图1 正常组人成纤维细胞 图2 UVA照射对照组人成纤维细胞 图3 加药组人成纤维细胞

图4 各实验组吸光度值比较情况

4 结论

从实验结果我们可以看到，绵头雪莲花提取物对UVA照射人成纤维细胞具有一定的保护作用，可以明显减轻UVA照射所导致的细胞形态改变和细胞活性降低。虽然各浓度组吸光度随浓度提高相应增加，但是统计学分析显示并不具有显著性差异。

5 讨论

皮肤的主要功能是保护机体免受物理和化学因素的损害[7]，但是反复长期的紫外线照射可影响人皮肤的多种细胞成分和组织结构破坏，导致皮肤紧致度降低、脆性增加、皱纹增多等多种老化表现，不断累积的紫外线照射甚至皮肤癌的发生[5,8]。皮肤慢性紫外线损伤最具特征性的变化是真皮成分的改变UVA、UVB、UVC照射可诱导人角质形成细胞和成纤维细胞产生和分泌大量基质金属蛋白酶(MMP)。MMP活化可以使细胞外基质蛋白发生降解作用，而基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)是其抑制剂，二者的平衡参与了人皮肤的许多生理与病理过程[9]。MMP和TIMP的失衡最终导致皮肤松弛、皱纹的发生。同时，光老化的发生还和真皮内的细胞内活性氧(ROS)水平增高所导致的胶原蛋白和弹性蛋白降解、MAPK通路激活有密切关系[4,10]。其中UVA在紫外线的皮肤损害中扮演了最为重要的角色[10]。目前针对皮肤光老化的预防和治疗方法，主要是外用防晒剂、抗氧化剂和抗光老化的护肤品，口服各种抗氧化剂和抗光老化的药物等[11]。但总的来说，疗效有限，而且许多抗光老化药物诸如糖皮质激素、羟氯喹、免疫抑制剂等均有程度不一的不良反应，限制了其在临床中的应用。

雪莲花别名又叫雪莲、雪荷花、大木花等，属菊科凤毛菊属植物。其记载最早见于藏药文献《月王药珍》和清代《本草纲目拾遗》。雪莲花常用的有绵头雪莲花、大苞雪莲花 、水母雪莲花等，主要生长于高海拔的寒冷地区。绵头雪莲花主要产于西藏、四川和云南的海拔4500米左右的高山岩石上、风化的流沙处或岩石缝中，与水母雪莲花等其他品种作为藏药材同等入药[12,13]。绵头雪莲花味甘 苦，温性，在藏医药中主要用于补肾壮阳、调经止血等，其功效具体表现为：消炎、止痛、抗炎、降低血压、降血脂、 调经止血、抗胃溃疡、 医治雪盲等。雪莲具有药理活性的化学成份主要是黄酮类、生物碱、内酯、甾醇、多糖及挥发油等多种成分；其主要的次生代谢产物是黄酮及黄酮甙类化合物[12,14]。有研究表明雪莲多糖和总黄酮含量高低直接影响到药材质量和临床疗效[15]。现代研究发现，人工培植雪莲花的总黄酮对炎症大鼠模型有明显的抗炎症作用，其中低浓度的作用效果与氢化可的松对照组的作用效果相似。雪莲花对炎症早期出现的渗出、 水肿有明显抑制作用[16,17]。也有实验发现雪莲花水提物的抗辐射损伤机制，其机制可能与清除氧自由基及防止染色体畸变有关[18-20]。张爱国等的研究发现雪莲花醇提液能够促进骨髓间充质干细胞的增殖活性[21]。来自香港的一个最新对比实验发现在绵头雪莲花、水母雪莲花和新疆雪莲花三个品种中，绵头雪莲花的抗炎治疗效果最好[6]。

目前对雪莲花的药效学研究中主要集中于其抗炎、抗辐射研究，其抗紫外线损伤及光老化的研究尚未见报道。我们选择雪莲花品系中抗炎效果最好的绵头雪莲花来进行抗光损伤和光老化的初步研究。实验发现绵头雪莲花提取物有效提高了UVA照射下的人成纤维细胞的吸光度，说明和UVA照射对照组相比其能够明显提高受试细胞的细胞活力，且差异具有显著性。虽然统计分析显示差别不具有显著性，但是随加入绵头雪莲花提取物浓度增高，受试细胞的吸光度也有相应提高。总之，本次实验初步证明绵头雪莲花对人成纤维细胞的UVA损伤具有一定的保护作用。提示我们绵头雪莲花可能具有抗皮肤紫外线损伤及光老化的有效药物成分，值得进一步对绵头雪莲花有效成分提取、药物活性分析及化学成分分析。

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(收稿：2017-04-06 修回：2017-05-15)

EffectsofSaussurealanicepsonhumanfibroblastsproliferationaffectedbyUVAirradiation

ZHENGBowen1,RUANGuanghong1,NIMacili2,LURongdawa2,QUHongye3,HUANGXiangzhong4,LIBing5,CHENGWenxiong5,XIAYujie5,DENGDangqi6.

1.DepartmentofDermatology,theSecondPeopleHospitalofYunnanProvince,theFourthAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650021,China; 2.DepartmentoftibetanMedicine,thePeopleHospitalofDeqinCounty,Diqing674500,China;3.DepartmentofOralRehabilitation,theDentalHospitalofYunnanProvince,Kunming650101,China; 4.KeyLaboratoryofChemistry,EthnicMedicinalResources,StateEthnicAffairsCommission&MinistryofEducation,SchoolofEthnicMedicine,YunnanMinzuUniversity,Kunming650504,China; 5.CenterforDrugSafetyEvaluation,KunmingInstituteofZoology,ChineseAcademyofSciences,Kunming650223,China;6.DepartmentofDermatology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicaluniversity,Kunming650101,China

XIAYujie,E-mail:xiayujie@mail.kiz.ac.cnDENGDanqi,E-mail:danqid128@sina.com

Objective: To determine the protective effects of the extract from Saussurea laniceps on the proliferation of human fibroblasts induced by UVA.Methods: The extract from Saussurea laniceps was prepared and the cultured human fibroblasts were divided into normal control group, UVA group and UVA+ Saussurea laniceps group. The cell proliferation activity was detected by CCK8 and the OD of cells was detected.Results: Dead cells in UVA+ Saussurea laniceps group were less than 5%, which was less than that in UVA group (20%～30%). OD in UVA+ Saussurea laniceps group was 1.16±0.22, which was higher than that in UVA group (0.5±0.12), with a significant difference (P<0.05).Conclusion: The extract of Saussurea laniceps has protective effects on human fibroblasts proliferation induced by UVA.

saussurea laniceps; ultraviolet; UVA; human fibroblasts

云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目(编号：2014FZ043)

1云南省第二人民医院皮肤科，昆明医科大学第四附属医院皮肤科，云南昆明,650021 2德钦县人民医院藏医科，云南迪庆,674500 3云南省口腔医院口腔修复科，云南昆明,650101 4云南民族大学民族医药学院，民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南昆明,650504 5中国科学院昆明动物研究所，灵长类研究中心，昆明，650223 6昆明医科大学第二附属医院皮肤科，650101

夏玉洁，E-mail: xiayujie@mail.kiz.ac.cn 邓丹琪，E-mail: danqid128@sina.com