铁皮石斛多糖抗阿司匹林诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的保护作用机制研究

吴 耽，江婷婷，赵 青，杨传玉，陈思颖，杨 畅，孙 佳，刘 亭，兰燕宇

(1. 贵州省药物制剂重点实验室；2. 贵州医科大学药学院；3. 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，4. 国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004)

◇研究简报◇

铁皮石斛多糖抗阿司匹林诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的保护作用机制研究

吴 耽1,2,4，江婷婷1,2，赵 青1,2，杨传玉1,3，陈思颖1,3，杨 畅1,3，孙 佳1,3，刘 亭1,3，兰燕宇1,3

(1. 贵州省药物制剂重点实验室；2. 贵州医科大学药学院；3. 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心，4. 国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004)

细胞因子(cytokine, CK)是由免疫细胞和非免疫细胞合成分泌的，存在于细胞间的一类具有调节机体免疫功能、介导炎症反应、参与组织修复和提高机体抵抗力的一类高效的功能蛋白质，其能感受外界因素对机体的刺激，并将信息传递给体内，可分为蛋白质、多肽或糖蛋白。大量文献报道，人胃黏膜上皮GES-1细胞受阿司匹林、乙醇、幽门螺杆菌损伤后，也会释放多种能诱导炎症发生的细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等[1-3]。同时，研究发现非甾体抗炎药可激活NF-κB通路，参与胃黏膜损伤的发生、发展[4-5]。

铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)的干燥茎，为我国传统名贵药材，具有益胃生津、滋阴清热的功效[6]。在铁皮石斛的前期的实验中发现，铁皮石斛多糖(polysaccharides fromDendrobiumofficinale, DOP)对阿司匹林损伤GES-1细胞具有保护作用[6]。基于此，本实验用DOP预处理GES-1细胞后加阿司匹林诱导损伤，对GES-1细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-6及其mRNA，以及NF-κB通路相关蛋白表达进行研究，为研发铁皮石斛抗胃黏膜损伤的机制研究提供理论基础。

1 材料

1.1细胞人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1，购于上海中科院细胞库，接种于含10%胎牛血清、1% 100 kU·L-1链霉素的DMEM培养液，于37℃、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养，隔天更换培养液，每3 d按1 ∶3比例传代。实验用细胞均为指数生长期细胞。

1.2药品与试剂阿司匹林(贵州圣都药业有限公司)；铁皮石斛药材(批号：20151109 ，贵州医科大学生药教研室龙庆德副教授鉴定)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(Gibco)；TRIzol总RNA提取试剂(Invitrogen)；TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(大连宝生物有限公司)；TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒(欣波盛生物科技有限公司)。

2 方法

2.1样品制备DOP的制备方法参见文献[6]，经硫酸苯酚法检测糖含量为30%。加DMSO溶解，配制成10g·L-1的母液，临用前用10%胎牛血清的DMEM培养液分别稀释。

2.2GES-1分组实验共分为5组，每实验组5个复孔。正常对照组，含10%胎牛血清的DMEM培养液，不加阿司匹林和药液；模型阿司匹林对照组，终浓度18.5 mmol·L-1[6]；药物组为浓度为50、100、300 ng·L-1的DOP预处理24 h后，加入阿司匹林，使其浓度为18.5 mmol·L-1混合液，各药物组作用GES-1细胞24 h后，取上清液进行后续实验。

2.3GES-1分泌TNF-α、IL-6及其mRNA表达水平GES-1细胞按“2.2”方法处理，按照相应试剂盒方法测定TNF-α、IL-6及其mRNA表达量。测定参照NCBI收录TNF-α、IL-6、GAPDH的mRNA的序列，引物设计与合成由重庆贝辉科技有限公司完成。

Tab 1 Effects of DOP pretreatment on TNF-α, IL-6 and mRNA expression in aspirin-induced GES-1 cells (±s,n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.4GES-1损伤NF-κB通路p-IκBα、IκBα、p65和p-p65蛋白表达水平测定按“2.2”法处理GES-1细胞，采用RIPA裂解缓冲液提取细胞中的蛋白， BCA法测定蛋白含量。用Quantity one凝胶图像分析系统分析，测定NF-κB通路相关蛋白和β-actin的灰度值的比值，反映蛋白p-IκBα、IκBα、p65和p-p65表达水平的影响。

3 结果

3.1DOP对GES-1分泌炎症因子TNF-α、IL-6及其mRNA表达水平的影响ELISA结果表明(Tab 1)，阿司匹林刺激GES-1细胞后，释放出大量的TNF-α、IL-6，与空白组比较差异有显著性(P<0.01)。多糖与阿司匹林共同作用细胞后，与模型组相比，各组的TNF-α、IL-6释放量明显减少，随药物浓度的增高，其含量逐渐降低，中、高剂量效果明显(P<0.05,P<0.01)。RT-PCR检测数据显示，阿司匹林刺激后IL-6、TNF-α mRNA表达与对照组比较均有所提高(P<0.01)，DOP能剂量依赖性地抑制相关mRNA表达(P<0.01)。

3.2DOP对阿司匹林诱导的GES-1细胞炎症信号通路NF-κB的p-IκBα、IκBα、p65和p-p65蛋白表达水平的影响Western blot结果显示(Tab 2)，与空白对照组相比，阿司匹林作用GES-1细胞24 h能明显增加IκBα、p65磷酸化水平，明显下调IκBα、p65的蛋白表达量。与模型组相比，DOP能剂量依赖性降低阿司匹林刺激引起的IκBα、p65磷酸化，上调IκBα、p65的蛋白表达量。

Tab 2 Effects of DOP on aspirin-induced expression ofNF-κB protein in GES-1 cells (±s,n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 讨论

该研究发现在阿司匹林诱导GES-1损伤模型中，阿司匹林能刺激GES-1细胞分泌TNF-α、IL-6因子并上调相关mRNA的表达，以及使IκBα、p65磷酸化水平明显上升、IκBα、p65的蛋白表达量明显下降。DOP在实验浓度内可下调TNF-α、IL-6的分泌和相关mRNA的表达、降低NF-κB通路中IκBα、p65磷酸化以及增加IκBα、p65的蛋白表达量，从而使GES-1损伤细胞炎症因子释放量及其mRNA表达水平趋于正常细胞，起到抗阿司匹林损伤作用。本实验初步表明DOP抗阿司匹林诱导GES-1损伤与NF-κB信号通路有关。

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TheprotectionmechanismofpolysaccharidefromDendrobiumofficinaleoninjuryofhumangastricepithelialcellsGES-1inducedbyaspirin

WU Dan1,2,4, JIANG Ting-ting1,2, ZHAO Qing1,2, YANG Chuan-yu1,3, CHEN Si-ying1,3, YANG Chang1,3, SUN Jia1,3, LIU Ting1,3, LAN Yan-yu1,3

(1.GuizhouProvincialKeyLabofPharmaceutics; 2.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity; 3.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM,MinistryofEducation; 4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao'sMedicines,Guiyang550004,China)

铁皮石斛；多糖；阿司匹林；GES-1细胞；NF-κB信号通路；机制

DendrobiumofficinaleKimura et Migo; polysaccharide; aspirin; GES-1 cells; NF-κB pathway; mechanism

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.029

A

：1001-1978(2017)10-1479-02

R-332；R284.1；R322.44；R392.12；R573；R971.1；R973

时间：2017-9-5 9:26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.058.html

2017-05-10,

2017-08-26

贵州省中药现代化科技产业研究开发项目(黔科合SY字[2014]3032-2号)；贵州省科学技术厅人才团队项目(黔科合平台人才[2016]56135677)

吴 耽(1994-)，女，硕士生，研究方向：中药新药研发与药代动力学，Tel: 0851-6908899，E-mail:695434494@qq.com; 兰燕宇(1958- )，女，教授，研究方向：中药药效物质基础及新药开发，通讯作者，Tel: 0851-86908468，E-mail: yanyu626 @ 126.com