脾气虚证模型大鼠尿液的1H-NMR代谢组学研究

罗 良，陈嘉辉，王园园，张晓君，尹西拳，卢碧钰，李 媛，郑海慧，谢智勇，廖琼峰

[1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2.无限极(中国)有限公司，广东 广州 510623； 3. 中山大学药学院，广东 广州 510006]

脾气虚证模型大鼠尿液的1H-NMR代谢组学研究

罗 良1，陈嘉辉1，王园园2，张晓君1，尹西拳2，卢碧钰1，李 媛1，郑海慧3，谢智勇3，廖琼峰1

[1. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；2.无限极(中国)有限公司，广东 广州 510623； 3. 中山大学药学院，广东 广州 510006]

脾气虚证；代谢组学；尿液；核磁共振；内源性代谢物；代谢通路

脾气虚证是临床常见的一种证型，主要表现为脾气不足，运化失职所致的虚弱症状。近年来，关于脾气虚本质的基础研究多集中于消化功能、能量代谢和免疫功能等方面[1]，不少学者致力于脾气虚证模型的生化指标研究，但是对于其代谢通路与病证之间的关系，我们知之甚少。代谢组学(metabonomics)是关于定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学[2]，是一种系统性、整体性的研究方法，与中医的整体观相符合。运用代谢组学进行分析有助于发现机体内源性物质的代谢途径，阐明中医脾气虚证的科学内涵。本文通过核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技术对脾气虚证模型大鼠的尿液进行分析，筛选出脾气虚证相关的差异代谢物，解释其代谢途径的生理意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SD ♂大鼠，SPF级，体质量180～220 g，由广东省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(粤)2013-0002，实验单位使用许可证号SYXK(粤)2013-0085，动物实验在广州中医药大学实验动物中心SPF级无菌层流环境中进行。动物随意进食、自由饮水，于代谢笼中收集尿液。控制环境温度22℃～26℃，相对湿度35%～75%，光照12 h，黑暗12 h。

1.1.2药物与试剂 大黄(RadixetRhizomaRhei)，购自广州致信药业有限公司，经广州中医药大学中药学院中药鉴定学教研室黄海波教授鉴定为正品；重水(D2O，含0.05% TSP，W/V)，购自美国Sigma公司；血清肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase, CPK)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；叠氮化钠(NaN3)、磷酸氢二钾(K2HPO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)均为分析纯，购自天津大茂化学试剂厂。

1.1.3仪器 Bruker 600 MHz AVANCE III NMR(德国Bruker公司)；5417R台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；AB135-S电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；MVS-1涡旋混合器(北京金紫光科技发展有限公司)；SB25-12DTD超声清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；KV-T1紫外-可见光分光光度计(南京肯凡电子科技有限公司)；DZKW恒温水浴锅(郑州南北仪器设备有限公司)。

1.2脾气虚证大鼠模型的建立复合因素造模是目前较为公认的脾气虚证动物模型造模方法，多因素诱导动物模型更符合中医脾气虚证复杂的发病机制[3]，因此我们采用苦寒泻下、劳倦过度和饥饱失常复合因素建立脾气虚证大鼠模型。

1.2.1大黄汤剂的制备 将大黄药材打成粉末，过5号筛，称重，加入10倍量煮沸后的蒸馏水，浸泡30 min，用纱布过滤。再加入8倍量煮沸后的蒸馏水，浸泡20 min，过滤。合并2次滤液于蒸发皿中，于水浴锅中蒸干，得大黄浸膏，称重，再用蒸馏水复溶浸膏至生药浓度为1 kg·L-1。

1.2.2分组与造模 将14只SD ♂大鼠适应性饲养7 d后，按随机数表分组法分为脾气虚证模型组(Spleen-Qi deficiency group，SQD group)和对照组(Control group)，每组7只大鼠。苦寒泻下：脾气虚证模型组每天按10 mL·kg-1灌胃给予1 kg·L-1冰冷大黄汤剂，对照组灌胃给予等量蒸馏水，连续14 d。劳倦过度：模型组大鼠负重游泳，于尾根部缠绕重量约为其体质量15%的砝码，放入水温23℃、水深50 cm的水桶中游泳，以力竭为度(即大鼠鼻尖没入水面10 s)，每日1次，连续14 d，对照组不作处理。饥饱失常：模型组隔日禁食，对照组大鼠不作处理。自然恢复：2组从d 15起至d 28给予体质量10%质量的饲料喂养，不作其他处理。生理指标记录：记录大鼠的进食量、饮水量和体质量。

1.2.3样品收集 分别于造模前1 d、造模d 7、14、28，收集大鼠的尿液，并进行离心处理，得到尿液样品。于造模d 14，进行大鼠眼眶后静脉丛取血，分离血清，得到血清样品。

1.3血清CPK活性测定取CPK标准品，用蒸馏水将其稀释成0.175、0.350、0.700、1.05、1.40、1.75、2.10、2.45、2.80、3.15、3.50 kU·L-1的系列标准溶液，加入试剂盒中的混合试剂与定磷剂，置于37℃水浴锅中5 min，然后涡旋混匀，离心10 min(1 400×g)，于660 nm波长处测定吸光度(OD)值，并绘制CPK标准曲线。同法测定模型组和对照组的血清样品，按照试剂盒说明书进行操作。血清CPK活性/kU·L-1)=[7.45×(测定OD值-对照OD值)-0.0716]×样品稀释倍数。

1.4代谢组学检测及分析

1.4.1NMR分析样品前处理 吸取尿样550 μL至1.5 mL离心管中，加入55 μL磷酸盐缓冲液(1.5 mol·L-1，K2HPO4/NaH2PO4=4 ∶1，pH 7.4，含0.1% NaN3、0.05% TSP，用D2O配制)，涡旋1 min，离心10 min(4℃，16 000 ×g)[4]，取上清液550 μL于5 mm核磁管中。

1.4.2NMR数据采集 调用Noesyprld脉冲序列[RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ]对信号进行采集，参数设定参考相关文献[5]的报道，设置如下：采样点数32 K，采样时间2 s，累加次数64次，混合时间80 ms，90°脉冲宽度11 μs，谱宽12 000 Hz，采样温度298 K。经傅里叶变换后，将自由感应衰减(free induction decay, FID)信号转为1H-NMR谱图。

1.4.3NMR数据的预处理 所有的核磁谱图在预处理前都乘以增宽因子0.3 Hz，提高信噪比。首先使用软件TOPSPIN 3.2(Bruker Biospin, Germany)对1H-NMR谱图进行相位校正、基线调整，以TSP(δ 0.00)进行化学位移定标；再采用软件AMIX 2.1(Bruker Biospin，Germany)对1H-NMR图谱的δ 0.5～9.5区域进行分段积分处理，积分间隔0.004 ppm。

1.4.4多元统计分析 将归一化处理后的积分数据导入软件SIMCA-P+13.0(Umetrics, Ume, Sweden)进行模式识别和多元统计分析，包括主成分分析(principal components analysis, PCA)、偏最小二乘法判别分析(partial least squares, PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal to partial least squares, OPLS-DA)，数据均采用中心化(mean-centering and not scaling, Ctr)处理。统计学分析采用软件SPSS 21.0，两组之间的比较采用独立样本t检验，结果以表示。

2 结果

2.1大鼠生理指标差异造模后，模型组大鼠出现便溏，肛周污秽，肌瘦无力，精神疲倦，嗜睡懒动，毛发疏散而枯槁的症状；正常组则大便正常，充满活力，毛发浓密而有光泽。造模过程和自然恢复过程中，模型组进食量，饮水量均低于对照组。模型组大鼠体质量增长缓慢，在d 7时就与对照组差异有显著性，d 14时，体质量低于对照组(P<0.05)，见Tab 1。根据中医虚证辩证参考标准[6]，判断脾气虚证大鼠模型建立成功。自然恢复14 d后，即d 28时，模型组大鼠体质量明显低于对照组(P<0.01)，表明模型组体质量增长抑制仍未改善。

2.3尿液代谢组学

2.3.1NMR图谱分析 Fig 1显示了造模结束d 14的模型组大鼠和对照组1H-NMR原始图谱。根据1H-NMR谱的化学位移和裂分模式，比对公共数据库HMDB(http://www.hmdb.ca/)及软件Chenomx NMR Suit 7.6(Chenomx, Canada)，对代谢物谱峰进行了归属和确认，共归属出50种代谢物，尿液中的代谢物主要包括三羧酸循环中间产物(柠檬酸、琥珀酸、延胡索酸、α-酮戊二酸等)、糖类(葡萄糖、蔗糖、海藻糖)、氨基酸(赖氨酸、组氨酸、脯氨酸、肌氨酸)、胺类物质(甲胺、二甲胺、三甲胺、氧化三甲胺)、芳香类化合物(马尿酸、苯丙氨酸、羟基苯乙酸)和一些脂类、核苷酸和胆碱类等。

Fig 1 Metabolites assignment with 1H-NMR spectroscopy

Typical 600 MHz1H-NMR spectra of urine from control group(A) and Spleen-Qi deficiency group(B).The expansion of δ7.98～9.16(C), the expansion of δ6.43～6.99(D) and the expansion of δ5.11～5.58(E)

2.3.2多元统计分析 模型验证结果如Tab 2所示，均符合标准，多元统计模型有效。从d 14 PCA得分图中可以看出，造模结束后，模型组与对照组的内源性代谢物得到良好分离(Fig 2)。另外，不同时间点的NMR数据通过主成分分析的轨迹图来直观体现两组样本代谢轮廓的整体动态变化(Fig 3)。同时将上述NMR数据导入软件GraphPad Prism 7，分析其随时间变化而变化的具体趋势(Fig 4)。显然，造模过程中，与自身对比，模型组与对照组的代谢轮廓均发生了变化。为了排除内源性代谢物自身变化的影响，采用OPLS-DA进行分析[7]，在OPLS-DA得分图中(Fig 2C)，模型组与对照组的内源性代谢物得到良好分离。

2.3.3差异代谢物筛选 在200次排列验证PLS-DA模型是有效的前提下，说明两组之间存在明显的区别，故可以进一步筛选差异代谢物。同时满足变化倍数(fold change，FC)>1.2且t检验P<0.05记为差异有显著性的代谢物[8]。我们从中挑选出33个差异代谢物，其中22个相对对照组降低，11个相对升高(Tab 3)。

Tab 1 Change in weight, food intake and water intake observed in Spleen-Qi deficiency group and control group(n=14)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 2 Parameters for model validation of rat urine

Fig 2 PCA score plots(A),PLS-DA permutations plots(B) and OPLS-DA score plots(C) of rat urine on day 14(n=14)

◆Control group;■:SQD group

Fig 3 Track of urinary metabolites change from day 1 to day 28(n=14)A:SQD group;B:Control group

Fig 4 Change of urinary PCA score average(n=14)

●→:Control group；■→:SQD group

2.3.4通路分析和富集分析 为进一步确定差异代谢物所影响的有意义的代谢通路，将d 14的所有差异代谢物数据导入MetaboAnalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)，参照相关文献[9-10]并选择合适的分析模式，获得通路影响分布图和代谢物集富集概况图(Fig 5)，用以解释真正发生变化的代谢通路。富集概况图中，富集倍数越大说明参与此条通路的代谢物越多，P值越大(颜色越深)，表示参与其中代谢物或代谢通路发生的变化越明显[11]。通路影响分布图中，每个圆的颜色和大小是基于P值和通路影响因子决定的，即节点颜色越深参与此通路的代谢物越多，节点越大则它在此次机体的整体代谢轮廓中占的比重越大，作用越明显[12]。通过KEGG PATHWAY数据库(http://www.genome.jp/kegg)检索相关代谢通路，对尿样中差异代谢物涉及的代谢通路进行整合分析。由Fig 6可见，脾气虚证影响了能量代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、胆汁酸合成，同时对肠道菌群存在干扰。

Tab 3 The peak assignment and statistically analysed results of main metabolites changed in urine on day 14(n=14)

↑:Up-regulation;↓:Down-regulation; s: Singlet; d: Doublet; t: Triplet; q: Quartet; m: Multiplet; dd: Doublet of doublets.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig 5 Meaningful metabolic pathways of urine

A: Metabolomics pathway analysis(MetPa); B: Metabolite set enrichment analysis(MSEA)

Fig 6 Metabolic pathways altered by Spleen-Qi deficiency

↑: Up-regulation; ↓: Down-regulation; TMA: trimethylamine; TMAO: Trimethylamine oxide

3 讨论

本研究运用基于1H-NMR的代谢组学分析技术对整个实验过程收集到的尿液进行检测，分析大鼠尿样中代谢物动态变化情况。造模结束后，模型组和对照组的代谢产物得到良好分离。模型组中内源性物质的代谢轨迹偏离正常轨道，随着时间的推移，有恢复到造模前状态的趋势。可见，代谢组学研究可以从脾气虚证复杂的内源性代谢产物中发现其变化规律，而且脾气虚证动物模型本身有一定的自愈性。 脾气虚证的症状表现为脾气不足，运化水谷精微功能减弱，以疲乏、腹胀、便溏为主要表现。造模结束后，模型组大鼠体质量增长受抑制，进食饮水减少、便溏，与脾气虚证的症状相符，说明我们的动物模型具有实际意义。CPK存在于大量消耗ATP的组织中，特别是骨骼肌，在骨骼肌的能量代谢过程中尤为重要[13]。脾气虚模型组血清CPK活性低于对照组，提示脾气虚模型组大鼠的能量代谢可能受到抑制。

在代谢通路分析和富集分析中，三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle, TCA cycle)是影响因素最大的通路，所以我们有必要对这条能量代谢通路进行详细的探究。三羧酸循环中4种重要中间产物的代谢都受到扰乱。与对照组相比，在脾气虚证模型组大鼠中，延胡索酸是上调的，而柠檬酸、酮戊二酸、琥珀酸则是下调，可见大鼠的三羧酸循环总体上受到抑制。我们继续分析其他代偿性的能量代谢通路：丙酮酸的代谢产物之一甲酸的含量减少，可见葡萄糖在无氧条件下进行的糖酵解受到抑制；甘油三酯含量的降低，导致脂质氧化也受到抑制；脂质β氧化产生的自由基被谷胱甘肽清除，在抗氧化过程中，谷胱甘肽也转化成氧化型谷胱甘肽，此过程也受到干扰；牛磺酸是保护细胞稳定的抗氧化剂，其含量下调，提示氧化应激过程被抑制，可能导致肝功能受损[14]。 另外，核苷酸和氨基酸可以通过各种反应参与能量代谢[15]，我们发现核苷酸代谢通路中的嘌呤代谢、嘧啶代谢以及多条氨基酸代谢通路受到抑制。受抑制的氨基酸代谢通路包括：酪氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸的代谢，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸的降解。其中，谷氨酰胺的含量下降具有重要的生理意义。谷氨酰胺是体内许多组织合成的非必需氨基酸，参与供能反应，对骨骼肌、胃肠道和免疫系统有着重要的作用，其含量下降可能会抑制骨骼肌中蛋白质的合成，破坏肠黏膜及导致机体免疫力下降。

这些结果共同验证了我们的假设：脾气虚模型大鼠的能量代谢通路受到扰乱，其供能不足，导致大鼠出现疲乏、嗜睡、毛发稀疏和体质量增长抑制等症状。生理生化指标分析结果和代谢通路分析结果共同说明脾气虚证大鼠存在能量代谢紊乱。由此可见，中医典籍中的“脾主肌肉”、“肌肉者，脾土所生也，脾气盛则肌肉丰满而充实”(黄元御《四圣心源》)所描述的脾与肌肉的关系，其实质是能量代谢受抑制。

而脾气虚证的便溏症状成因可能是干扰了肠道菌群。据文献报道[14]，胆碱通过肠道菌群的作用转化为三甲胺，三甲胺通过肝的生物转化形成氧化三甲胺。而我们观察到三甲胺的含量上调，氧化三甲胺的含量下调,可能是肠道菌群的干预和肝功能损伤的共同作用结果；胆碱同时也能转化为肌酸酐，其含量下调，可能导致肌肉细胞供能不足。这提示我们可以结合粪便样本进一步分析脾气虚证与肠道菌群的关系。

综上所述，本文所建立的1H-NMR代谢组学分析技术，对脾气虚证的疲乏和便溏症状的病因进行了解释，为脾气虚证的发病机制提供了一种有效的非靶标代谢组学研究方法，为中医病证的基础研究提供了一种新的研究思路。

(致谢：本研究在广州中医药大学中药学院药物分析与药物代谢研究室和中山大学药学院谢智勇教授PI组实验室完成，在此表示感谢！)

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1H-NMR-basedmetabonomicsstudyonurineofratwithSpleen-Qideficiencypattern

LUO Liang1, CHEN Jia-hui1, WANG Yuan-yuan2, ZHANG Xiao-jun1,YIN Xi-quan2, LU Bi-yu1, LI Yuan1, ZHENG Hai-hui3, XIE Zhi-yong3, LIAO Qiong-feng1

(1.SchoolofChineseMateriaMedica,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China;2.Infinitus(China)CompanyLtd.,Guangzhou510623,China;3.SchoolofPharmaceuticalSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510006,China)

AimTo establish the rat model of Spleen-Qi deficiency, analyse the metabolic pathways and investigate the connection between the changed urinary metabolites and Spleen-Qi deficiency, in order to explore the potential mechanisms of Spleen-Qi deficiency.MethodsWith the binding methods of diarrhea induced by bitter and cold, abnormal of starvation and excessive tiredness, the rat Spleen-Qi deficiency model was established. Then the activity of creatine phosphokinase(CPK) was detected. The endogenous metabolites in the urine were detected by NMR, and the data were analyzed with multivariate and statistical methods. Then the metabolites were selected that could be clearly distinct in the two groups with the fold change value(>1.2) and theP<0.05 of Student′s t-test. Both the pathway analysis and enrichment analysis were performed with Metabo Analyst 3.0.ResultsCompared with the normal rats, the activity of CPK decreased significantly in model rats(P<0.05). A significant separation appeared in the principal components analysis(PCA) score plot when the control group and the model group were compared, indicating that the Spleen-Qi deficiency model was successfully duplicated. The 33 differential metabolites, which mainly involved in the metabolic pathways, were distinguished from the comparision of Spleen-Qi deficiency model group and control group. The metabolic pathways was related to energy metabolism, amino acid metabolism, nucleotide metabolism and disturbance of gut microbes.ConclusionsThe main energy metabolic pathways (tricarboxylic acid cycle, glycolysis and liquid oxidation) may be disturbed in Spleen-Qi deficiency rats. The energy supply function is suppressed, which leads to the fatigue and weight loss in rats.

Spleen-Qi deficiency; metabonomics; urine;1H-NMR; endogenous metabolites; metabolic pathways

：目的建立脾气虚证大鼠模型，分析脾气虚证的代谢通路，探究内源性代谢产物变化与脾气虚证的关系。方法采用苦寒泻下、劳倦过度和饥饱失常复合因素方法建立并评价脾气虚证大鼠模型，检测其血清中肌酸磷酸激酶活性；对大鼠尿液进行1H-NMR检测，以变化倍数(fold change，FC)>1.2,结合独立样本t检验(P<0.05)的统计学方法筛选脾气虚证模型组和对照组的差异代谢物，进行代谢通路分析与富集分析。结果脾气虚证模型建立成功；模型组的肌酸磷酸激酶活性低于对照组(P<0.05)；从主成分分析(PCA)结果得出模型组和对照组的代谢产物得到明显区分；筛选出33种差异代谢物，主要参与的代谢通路涉及能量代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢，同时对肠道菌群存在干扰。结论脾气虚主要扰乱了大鼠的能量代谢通路(三羧酸循环、糖酵解、脂质氧化)，抑制了供能作用，导致大鼠出现疲乏和体质量增长抑制的症状。

时间：2017-9-5 9:25 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.016.html

2017-05-16,

2017-08-20

国家自然科学基金资助项目(No 81473540，81473319)；广东省科技计划项目(No 2014A020221027，2013B090800 011，2014B040404010，2015A030401031)；广东省自然科学基金资助项目(No 015A030313123)

罗 良(1992-)，男，硕士生，研究方向：中药药效物质基础、肠道微生态学，E-mail: luo.liang28@163.com； 廖琼峰(1975-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药药效物质基础、肠道微生态学，通讯作者，E-mail: liaoqf2075@yahoo.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.008

A

：1001-1978(2017)10-1363-08

R-332； R256.39；R285.6； R445.2；R446.1；R589