张治金++++++全仁夫++++++岳振双++++++朱芳兵
[摘要] 组织工程修复软骨缺损是组织工程技术运用于临床最具可行性的研究领域之一,而种子细胞是软骨组织工程研究及临床应用的基本要素和首要环节。本文结合国内外的研究成果,对组织工程修复软骨缺损中种子细胞的研究现状进行回顾,综述种子细胞的特点、来源、种类以及培养和鉴定,以期为软骨组织工程的进一步发展提供依据。
[关键词] 软骨缺损;组织工程;种子细胞
[中图分类号] R687.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2017)08(b)-0036-04
[Abstract] Tissue engineering cartilage repair tissue engineering technology is applied to the clinical one of the most feasible research field, and the seed cell is cartilage tissue engineering research and clinical application of the basic elements and the primary link. In this paper, combining the domestic and foreign research results, the research status of seed cells in cartilage defects repairing tissue engineering was reviewed. The characteristics, sources, species and culture of seed cells are reviewed in order to provide the basis for the further development of cartilage tissue engineering.
[Key words] Cartilage defect; Tissue-engineeved cartilage; Seeding cells
關节软骨缺损带来的顽固性疼痛和关节障碍,严重影响了患者的生活质量。随着软骨组织工程的发展给关节软骨缺损的患者带来了福音,利用组织工程技术修复软骨缺损的研究及临床应用取得较大的成功[1]。但软骨组织修复工程在临床上的直接应用尚有一段差距,因此有必要分析现有的研究和面临的挑战,以更好的缩短差距。而种子细胞是软骨组织工程中最基本的,也是首要环节。本文就种子细胞的特点、来源、种类以及培养进行综述。
1 种子细胞的特点
软骨组织工程修复软骨缺损的研究30余年,理想的种子细胞一直是研究的热点,也是研究者们亟待解决的问题。它应该具备以下特点,①取材:便于获取,来源丰富,且对供体的伤害降到最低;②增殖:增殖力强,在体外培养能迅速生长,增殖至构建软骨组织所需的基础细胞数;③黏附:黏附率高,可以较稳定的黏附支架生长;④生物学特性:遗传背景稳定,构建的软骨组织应与植入患者的生理软骨具有相同的生物学功能,且在修复的各阶段均能保持软骨表型的稳定,维持自身稳态,在体内长期存活;⑤生物安全性:无明显的免疫排斥或者免疫排斥反应不对机体造成伤害,同时在体外培养以及体内适应、重塑等阶段毒性作用和致瘤性较小。经诱导后可向软骨细胞分化是种子细胞的基本要求,而能分泌和合成软骨细胞所需要的特异性基质是重要的条件之一。
2 种子细胞的来源
种子细胞的来源遵循种子细胞特有的要求,主要以自体、同种异体和异种为主。自体细胞取自患者自身,不发生免疫排斥反应是其最大的优点,但其取材可造成患者的创伤和痛苦,对于自身干细胞或者基因缺陷以及患有传染性疾病的患者均不适宜选用自体细胞,且自体细胞存在数量局限以及多代培养出现细胞老化的问题。同种异体细胞可在事先进行培养制备,但其可能存在免疫排斥反应。异种细胞取材方便,来源广泛,但其需要进行抗免疫排斥反应,存在动物病毒传染的风险。但刘艺昌等[2]通过对同种异体和异种来源的骨髓间充质干细胞诱导软骨细胞移植修复兔喉软骨缺损,均取得良好的疗效,且二者在修复效果上并无差距,这也无疑为种子细胞的来源提供了新的理论基础。目前,在临床上为了规避免疫排斥反应,种子细胞的主要来源集中于自体细胞,且随着诱导多能干细胞技术的发展,自体多能干细胞为软骨组织工程提供了更丰富、广泛的种子细胞来源[3-4]。
3 种子细胞的种类
3.1 软骨细胞
3.1.1 软骨细胞的增殖
软骨细胞作为关节软骨组织工程的种子细胞源的关键在于软骨细胞自身的维持以及其产生Ⅱ型胶原等细胞外基质的维持。然而软骨细胞仅占软骨组织的5%~10%,其体外扩增显得尤为重要。国外学者发现,单层培养软骨细胞,软骨细胞的基因表达在第1代既已发生改变[5]。研究发现通过改变底物以及生长因子可以预防或减缓单层培养软骨细胞所出现的去分化的问题[6]。同时,软骨细胞扩增过程中影响细胞聚集物形态及行为的重要因素是种植的密度。Freed等[7]在藻(朊)酸盐海绵上灌注进行软骨细胞的培养,发现低密度的软骨细胞种植密度的蓄积扩增率明显高于中高密度的蓄积扩增率。
3.1.2 软骨细胞的来源
自体软骨细胞的提取简易便行,通过胰蛋白酶及Ⅱ型胶原蛋白酶的作用,即可提取纯度较高的软骨细胞,不存在免疫反应,是最早应用的一类种子细胞。但因其是分化的终末自体细胞,增殖力低,一般在3代以后细胞表型发生改变,出现“去分化”现象,丧失成软骨能力。同种异体软骨细胞存在于细胞外基质中具有一定的抗免疫排斥的作用,又因在酶消化等处理后抗原性减弱,其免疫排斥作用不明显,来源广泛,有效的解决细胞来源不足的问题。但存在可能传染疾病的风险,且也对供体造成伤害。异种软骨细胞虽然可在短时间内大量获取,但植入体内后免疫排斥严重,故临床上较少应用。endprint
3.1.3 软骨细胞的研究及应用
闫虎等[8]应用用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法获取大量生长速度快且不易退变的新西兰兔膝关节的软骨细胞,发现在3代以前的兔软骨细胞最适宜。耿书国等[9]通过改良胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶序贯消化法、刘小荣等[10]采用单纯Ⅱ型胶原酶法、王林林等[11]则采用机械-双酶法提取软骨细胞均可建立良好的软骨细胞分离及培养体系。唐新等[12]取全膝关节置换患者残存的软骨用双酶法进行提取及体外培养,在4代以内软骨细胞生长良好,生物特性明显,4代后出现“去分化”现象。王斌等[13]采用基质诱导自体软骨细胞移植治疗股骨滑车软骨损伤10例,患者移植手术成功,且近期疗效较好,创伤较小,恢复较快。Zhang等[14]的研究同樣也证明了自体软骨细胞移植术可有效修复关节软骨缺损。
3.2 干细胞
干细胞相对于成熟的软骨细胞具有多向分化和较长时间或无限自我更新的能力,在组织工程修复软骨缺损的研究中为研究热点。其中胚胎干细胞以及间充质干细胞为重点的研究种子细胞。
3.2.1 胚胎干细胞
胚胎干细胞是一类高度未分化的细胞,其具备全能性、无限增殖性、易对基因进行修改、端粒酶活性高等生物特性,可在特定的条件下诱导分化成软骨细胞。但是胚胎干细胞定向分化诱导成软骨细胞是现阶段的研究难点。在胚胎干细胞向软骨细胞的定向分化的过程中,细胞外基质的组成、几何构型及表面粗糙度、电荷性质都会对软骨的形成产生巨大的影响。胚胎干细胞所处的环境可对软骨细胞的增殖和纯度产生影响,Jukes等[15]发现由4 mm厚度PEOT/PBT3D混合共聚物构成的软骨支架更适用于软骨细胞的分化。不同的诱导物对胚胎干细胞的分化能力是不同的,现已研究发现的诱导物除了细胞生长因子,还有地塞米松、甲状腺素、前列腺素E2和抗坏血酸、中药有效成分等。
3.2.2 间充质干细胞
间充质干细胞来源丰富,具有多向分化的能力,且不会因为来源不同而受到影响[16],但是不同来源的间充质干细胞有特定的分化谱系,如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、滑膜间充质干细胞[17]、脐带血间充质干细胞[18]等。现阶段骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞都是软骨组织工程的研究热点。
3.2.2.1 骨髓间充质干细胞 骨髓间充质干细胞来自中胚层,来源广泛,具有高度自我更新和多向分化的潜能[19];明显的趋化性,向损伤组织集中;较强的免疫抑制性,利于自体或异体移植等生物特性,且其诱导分化成软骨细胞的方法已经相对成熟。目前较常使用的分离骨髓间充质干细胞的方法是密度梯度离心与贴壁筛选结合,操作简便且纯度较高。研究证明,转化生长因子(TGF)以及胰岛素生长因子具有明显诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[20]。另外地塞米松、维生素C、中药[21]等也可诱导分化骨髓间充质干细胞向软骨分化。骨髓间充质干细胞分化软骨移植术治疗软骨缺损已应用于临床。Bernardo等[22]通过实验证明骨髓间充质干细胞相对于其他来源的种子细胞成软骨能力最强。但是骨髓间充质干细胞数量较少,仅占骨髓细胞的1/104~1/105。另有研究发现骨髓间充质干细胞存在培养传代至90代后癌变的风险[23],其安全性还需要长期的研究和观察。安荣泽等[24]研究发现在特定的单层培养条件下,脂肪干细胞及骨髓间充质干细胞均能向软骨细胞转化,但脂肪干细胞的生长增殖孙渡较快,而骨髓间充质干细胞具有更高的潜能。
3.2.2.2 脂肪间充质干细胞 脂肪间充质干细胞同样来自中胚层,具有与骨髓间充质干细胞相似的生物特性,具有以下特点:取材方便,来源丰富,脂肪来源的间充质干细胞较骨髓间充质干细胞丰富;抗原性低;不易发生癌变,易体外进化;且具有多向分化的潜能。脂肪间充质干细胞在地塞米松、VD3以及细胞因子的诱导下可分化成软骨细胞。国外研究表明脂肪间充质干细胞在多向分化潜能、生长动力学、细胞衰亡、表面标志等方面与骨髓间充质干细胞无明显差异。郭宝锋等[25]体外培养脂肪间充质干细胞,传代稳定,间质细胞及干细胞相关标志CD34和CD13表达阳性,定向诱导后表现出软骨特性。但研究表明,骨髓间充质干细胞分化软骨细胞能力较脂肪间充质干细胞较强[26]。也有研究推测,虽然脂肪间充质干细胞虽然能分化成软骨细胞,但骨髓重建能力有限[27]。
3.3 软骨细胞和干细胞共培养
现有的单一来源的种子细胞无法满足组织工程修复软骨缺损的需要,体外单一因子培养扩增的软骨因子往往无法与体内成熟的软骨细胞融合修复;而干细胞分化成软骨细胞所需的数量较大且分化培养费用昂贵,因此,越来越多的研究倾向于将两类的种子细胞进行联合培养。王万宗等[28]选用第3代大鼠骨髓间充质干细胞与关节软骨细胞按1∶1的细胞比例进行培养,发现软骨细胞分泌物促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞样分化,而骨髓间充质干细胞分泌的细胞因子,促进组织细胞分化,使关节软骨细胞功能加强。谢鹏等[29]采用自体兔骨髓间充质干细胞与同种异体的软骨细胞按照2∶1的细胞比例培养,发现共培养相对于单一软骨细胞培养的模式,一方面软骨细胞可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化,另一方面减少软骨细胞培养时间和传代次数。李兴福等[30]发现人脐带间充质干细胞和人关节软骨细胞的比例为5∶1时,可明显促进人脐带间充质干细胞向软骨样细胞诱导分化,并抑制细胞纤维化,降低成本。
4 种子细胞的培养
种子细胞采用单层细胞培养体系易向纤维细胞分化的倾向,目前仅用于软骨细胞的扩增。三维立体培养体系有利于细胞的气体交换,营养摄取以及废物的排出,同时也有利于细胞外基质的分泌。三维立体培养可降解,可制成缺损软骨所需要修复的形状进行培养。生物反应器培养体系模拟人体内细胞和组织的生长环境,其要求种子细胞均匀的分布在三维结构上,给予一定的力学刺激,促进营养的供给和代谢的排出,降低成本。韩长旭等[31]发现理化因素在种子细胞的培养中,同样占据着重要的作用,其通过对文献的整理发现剪切力通常被对软骨细胞表型认为是有害的,现有的培养模式中的理化刺激需要改进。现有模拟微重力旋转、固体转动、搅动混合旋转、环绕混合等生物反应器。Freed等[32]较为系统的研究了这4种生物反应器,发现模拟微重力旋转生物反应器系统因提供了培养环境所需的力学平衡,促进了软骨细胞的形成。endprint
5 小结与展望
随着软骨组织修复工程研究的发展,软骨组织工程中种子细胞源越来越丰富,尤其是共培养软骨细胞在提高软骨细胞的质量和培养效率都取得了进步。虽然所面临的前期困难已得到基本解决,如数量少、免疫性问题以及细胞表型不稳定等,但不可否认依然还存在诸多问题,如何确定种子细胞的安全性,提高种子细胞诱导分化的效率,其远期疗效的确定以及成分的降低。相信随着种子细胞源的进一步丰富、纯化及培养条件的优化,种子细胞的问题终将得以解决,缩短组织工程修复软骨缺损深入临床应用的距离。
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