改良配制方法下青霉素钠皮试液稳定性考察

宛霞　潘静　肖伟

[摘要] 目的 考察青霉素钠皮试液在2～8℃环境下放置4 h后其有关物质的变化，用于指导注射用青霉素钠的使用。 方法 采用高效液相法对青霉素钠样品进行分析。使用Red Classical C18色谱柱（5 μm，150.0 mm×4.6 mm），磷酸盐缓冲液、甲醇和乙腈为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为225 nm，柱温34℃，进样量20 μL。 结果 经过酸碱破坏后的青霉素溶液杂质含量会升高，并产生新的杂质，而放置4 h后的青霉素溶液则未产生新的杂质。青霉素钠样品在放置前后其溶液中杂质F含量没有明显变化，杂质A、B、C、D、E有一定的变化，但杂质总和未超过对照溶液主峰面积。 结论 改良配制方法简化了配制流程，青霉素钠皮试液2～8℃环境下放置4 h过程中有关物质含量有所上升，增加了假阳性发生的可能，建议尽量在较短时间内使用。

[关键词] 青霉素钠；皮试液；稳定性；有关物质

[中图分类号] R927.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（a）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the changes of related substance of Penicillin Sodium skin test solution after keeping at 2-8℃ environment for 4 h， in order to guide the use of Penicillin Sodium for injection. Methods High performance liquid chromatography was used to analyze the samples of Penicillin Sodium. The Red Classical C18 chromatographic column （5 μm， 150.0 mm×4.6 mm） was adopted， phosphate buffer， methanol and acetonitrile were used as mobile phase， with the flow rate of 1.0 mL/min. The detecting wave length was set at 225 nm， the column temperature was 34℃ and the injection volume was 20 μL. Results The content of impurities in Penicillin solution would increase after acid or base destruction and the new impurities would appear， while there were no new impurities appeared in the Penicillin solution after storage for 4 h. The content of impurity F in skin test solution of Penicillin Sodium samples had no significant changes before and after storage， while the contents of impurities A， B， C， D， E had certain changes， but the total content of impurities was not more than the corresponding main area of the control solution. Conclusion The modified preparation method simplifies the preparation process. The content of related substance of Penicillin Sodium skin test solution will increase after keeping for 4 h at 2-8℃， which increase the possibility of false positive result， therefore， Penicillin Sodium should be used during shorter time.

[Key words] Penicillin Sodium； Skin test solution； Stability， Related substance

青霉素类药物属于β-内酰胺类抗生素，对多种细菌感染具有很好的治疗效果，在临床上常作为首选药物[1-3]，其降解产物可与蛋白质结合引起变态反应，临床使用前患者需完善皮试，減少药物变态反应的发生，青霉素皮试液的配制方法较多[4-5]，南京医科大学附属儿童医院目前使用的是青霉素皮试液改良配制方法，即将青霉素皮试液放置成规定浓度后，在2～8℃条件下储存，在4 h内备用。该方法克服了传统配制过程“三抽、三混匀、二推”的复杂操作，但是储存过程是否可以保证皮试液不发生降解，避免因杂质含量上升引起阳性结果是临床护理工作关心的重点[6-7]。目前，已有研究提示青霉素皮试液在室温下放置4 h后含量不会降低[8-9]，但是未报道其降解产物变化情况。本研究希望参照2015年版《中国药典》[10]596～599有关要求对于2～8℃环境下放置4 h后的降解产物进行含量分析，进一步保证皮试结果准确性和临床使用安全性。2015年版《中国药典》[10]提示注射用青霉素钠中主要有关物质包括2-羟基-5、5-二甲基噻唑烷-4-羧酸、2-[（苯乙酰基）氨基]-乙酸、青霉酸二聚体等，在紫外225 nm处均有吸收，故本研究采用高效液相等度洗脱的方法进行检测。endprint

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪（UltiMate 3000高效液相色谱泵，UltiMate 3000紫外检测器，Chromeleon色谱数据工作站），美国Dionex公司；Newclassic电子天平，南京科翔仪器设备有限公司；PHS-3C型pH计，上海雷磁仪器有限公司；BCD-539WL型冰箱，青岛海尔股份有限公司。

1.2 试药

青霉素系统适应性对照品，中国药品生物制品检定所；注射用青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司（批号：B150610）；磷酸二氢钾（分析纯），南京化学试剂有限公司；磷酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯），西陇化工股份有限公司；盐酸（分析纯），西陇化工股份有限公司；甲醇（色谱级），美国Tedia；乙腈（色谱纯），美国Tedia。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件及系统适应性 采用Red Classical C18色谱柱（5 μm，150.0 mm×4.6 mm），参照《中国药典》（2015版）[10]青霉素钠有关物质检查项下，以磷酸盐缓冲液-甲醇（72∶14）为流动相A，乙腈為流动相B。流动相A∶流动相B=86.5∶13.5，流速为1.0 mL/min，柱温34℃，进样量为20 μL，波长为225 nm。在此色谱条件下对系统适应性对照品进行检测，记录色谱图。

1.3.2 流动相与样品配制 流动相A：称取10.6 g磷酸二氢钾，加水至1000 mL，调节pH至3.4，得到磷酸缓冲液。取磷酸缓冲液720 mL，甲醇140 mL，混匀后超声，得到流动相A。取超声过的乙腈作为流动相B。青霉素钠样品：精密称取青霉素钠0.04 g于10 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。青霉素钠放置样品：将青霉素钠样品置于2～8℃冰箱放置4 h后取出。酸破坏样品：精密称取0.04 g青霉素于10 mL容量瓶中，适量水溶解，加50 μL 0.1 mol/L的盐酸溶液，静置10 min后，加等量0.1 mol/L的NaOH溶液中和，并加水稀释至刻度线。碱破坏样品：精密称取0.04 g青霉素钠样品于10 mL容量瓶中，适量水溶解，加50 μL 0.1 mol/L的NaOH溶液，静置10 min，加等量0.1 mol/L的盐酸溶液，加水稀释至刻度线。对照溶液：取1 mL青霉素钠样品溶液于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度。

1.4 统计学方法

数据采用SPSS 19.0进行统计学检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 色谱条件及系统适应性

青霉素主成分保留时间在23.70 min左右，理论塔板数不小于4000，分离度良好。如图1所示，将杂质A、B、C、D、E、F所对应的峰面积分别与主峰面积相比，得到比值，并对放置前的样品作对比（按《中国药典》[10]规定，所有杂质峰面积的总和不能超过对照溶液的主峰面积），结果显示，有关物质A、B、C、D、E、F均有较好的分离度。

2.2 有关物质变化

酸破坏样品色谱图见图2，青霉素钠样品经过酸破坏后杂质B的含量明显升高，同时还会出现一个新的杂质G；碱破坏样品色谱图见图3，经过碱破坏后杂质B、D含量明显增加，并且还会出现新的杂质H。有关物质的变化情况见表1。而青霉素钠样品杂质峰总面积约为1.2，样品放置后的杂质峰总面积约为1.3，均小于对照溶液主峰面积10.8，均未超过《中国药典》[10]中对青霉素钠有关物质项下的规定。

3 讨论

黄春莲等[11]曾经报道过青霉素钠皮试液在静置4 h后浓度没有明显改变，得出该改良配制方法下的皮试液稳定性好的结论。但是相关杂质是引起青霉素使用者过敏的主要原因，也是引起皮试液假阳性的因素[12-13]，所以基于杂质变化情况的研究结果可信度会更高。

本研究利用HPLC法检测了皮试液有关物质变化的情况，关于皮试液稳定性的研究结论更可靠。配制液静置4 h后，杂质A、B、C、D、E有明显变化，而杂质F无显著性变化。根据《中国药典》[10]青霉素钠有关物质检查项，杂质总和未超过对照溶液主峰面积，说明溶液放置4 h后，某些杂质含量会升高，但是暂未超过药典标准，表明青霉素钠溶液放置4 h后仍未变质。因此，改良配制方法简化了配制流程，但在静置过程中有关物质含量有所上升，潜在增加假阳性发生的比率，需尽量在较短的时间内使用。

本研究改进了青霉素有关物质检测的色谱条件，分离程度更好，检测效能更高。王润彪等[14]对青霉素有关物质检测时采用梯度洗脱法，而在实际操作过程中发现梯度洗脱基线不稳定，某些色谱峰也难以得到很好的分离，而采用等度洗脱的方法时，其图谱能达到分析要求。使用磷酸盐缓冲液作为流动相时，由于缓冲液含量过高，容易堵塞液相管路，在测定过程中应注意经常冲洗。

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（收稿日期：2017-02-16 本文编辑：张瑜杰）endprint