信号转导和转录活化因子3和碱性螺旋—环—螺旋转录因子1在卵巢恶性上皮肿瘤中的表达

洪莉+杨将+邢辉

[摘要] 目的 探讨信号转导和转录活化因子3（STAT3）和碱性螺旋-环-螺旋转录因子1（Twist1）在卵巢恶性上皮肿瘤中的表达，并分析其表达失调与卵巢癌发生和发展的关系。 方法 收集2015年3月～2016年12月于武汉大学人民医院行手术的49例卵巢恶性上皮肿瘤患者和14例卵巢良性肿瘤患者的组织，应用免疫组化SP法检测STAT3和Twist1蛋白的表达情况，比较其在早期卵巢癌和晚期卵巢癌中的表达差异，并作Pearson相关性分析。 结果 STAT3和Twist1在卵巢癌中的阳性表达率明显高于卵巢良性肿瘤，差异有统计学意义（P < 0.05）；二者在晚期卵巢癌患者中的阳性表达率明显高于早期卵巢癌，差异有统计学意义（P < 0.05）；Twist1与STAT3在早期和晚期卵巢癌中的阳性表达均呈正相关（r = 0.653、0.798，均P < 0.05）。 结论 STAT3和Twist1在卵巢癌的发生、发展和恶化中发挥着重要作用，其阳性表达率与卵巢癌FIGO分期相关，其机制可能是通过上皮-间质转化实现的。

[关键词] 信号转导和转录活化因子3；碱性螺旋-环-螺旋转录因子1；相关性；卵巢恶性上皮肿瘤

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0118-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of signal transducer and activators of transcription 3 （STAT3） and Twist basic helix-loop-helix transcription factor 1（Twist1） in epithelial ovarian cancer， and to analyze the relationship between the expression dysregulation and the occurrence and development of ovarian cancer. Methods The tissue of 49 cases with epithelial ovarian cancer and 14 cases with ovarian benign tumor taken surgery in Renmin Hospital of Wuhan University from March 2015 to December 2016 were collected. The expression of STAT3 and Twist1 protein was examined by immunohistochemistry streptavidin peroxidase conjugated method， the expression differences of which in early ovarian cancer and advanced ovarian cancer were compared and analyzed by Pearson correlation analysis. Results The positive expression rates of STAT3 and Twist1 in ovarian cancer were significantly higher than those of ovarian benign tumor， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rates of STAT3 and Twist1 in the advanced ovarian cancer were higher than those of early ovarian cancer， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The positive expression of Twist1 in early ovarian cancer and advanced ovarian cancer was both positively correlated with STAT3（r = 0.653， 0.798， all P < 0.05）. Conclusion The expression of STAT3 and Twist1 plays an important role in the occurrence， development and deterioration of ovarian cancer， the positive expression rate has correlation with FIGO stage of ovarian cancer， and the mechanism may be achieved through epithelial-mesenehymal transition.

[Key words] Signal transducer and activators of transcription 3； Twist basic helix-loop-helix transcription factor 1； Correlation； Epithelial ovarian cancer

卵巢癌是女性生殖系統三大恶性肿瘤之一，近年来发病率呈逐年上升趋势。调查显示[1]，全世界每年新增病例约22万例，约14万妇女死亡，居全球女性生殖系统肿瘤死亡原因首位。因其具有早期症状不明显、易转移等特点，70%的患者在首次就诊时已是晚期。据流行病学统计，怀孕或第1次生产年龄过早（≤25岁）或过晚（>35岁）、使用口服避孕药以及拒绝母乳喂养等均可增加卵巢癌的发生风险。但其分子机制目前尚无绝对定论。Avtanski等[2]在乳腺癌的研究中显示，信号转导和转录活化因子3（signal transducer and activators of transcription，STAT3）能够调控上皮-间质转化（epithelial-mesenehymal transition，EMT）促进乳腺癌侵袭和转移。碱性螺旋-环-螺旋转录因子1（Twist basic helix-loop-helix transcription factor 1，Twist1）作为EMT发生中的关键转录因子，使肿瘤细胞膜上具有上皮特性的E钙黏蛋白（E-cadherin）表达降低，具有间质特性的N钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达增高，导致癌细胞侵袭能力增强[3-4]。在卵巢癌中，STAT3与Twist1之间的联系尚不明确，本研究通过组织水平研究，进一步阐明卵巢癌发生发展的分子机制。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集武汉大学人民医院2015年3月～2016年12月卵巢上皮癌标本49例、卵巢良性肿瘤14例进行研究，术后均经病理证实。患者均为女性，年龄42～76岁，平均（63.4±5.2）岁。术前均未接受过化疗、放疗或免疫等抗肿瘤治疗。FIGO分期：Ⅰ期13例，Ⅱ期22例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。经医院伦理委员会批准，充分告知参与者实验相关事项并取得知情同意。

1.2 材料和试剂

所有组织样本均选取部分于4%甲醛溶液固定24 h后石蜡包埋，剩余部分于-70℃储存，用于组织蛋白的提取。二氨基联苯胺（DAB）显色剂和S-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；抗体STAT3和抗体Twist1分别购自美国CST公司和Abcam公司。

1.3 方法

免疫組化染色采用链霉亲和素-生物素复合物技术法（S-P法）。主要操作步骤：常规行组织标本脱蜡、水化、抗原修复、阻断、封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，DAB显色。苏木精复染，脱水、透明、封片，于正置显微镜下选择400倍视野，每张免疫组化片上随机选择5个视野，每个视野拍摄5幅照片。

1.4 评价标准

免疫组化结果判定：免疫组化结果采用半定量判定分析[5]。根据阳性细胞比例评分：≤5%细胞着色为0分；>5%～25%细胞着色为1分；>25%～50%细胞着色为2分；>50%～75%细胞着色为3分；>75%细胞着色为4分。按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例评分与染色强度评分乘积为染色总评分：≤2分为阴性；≥3分为阳性表达，其中3～4分为弱阳性，5～6分为阳性，≥7分为强阳性。结果均由有经验的病理科医生采用盲法评估。FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期为早期，Ⅲ～Ⅳ期为晚期。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析，计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验；相关分析采用Pearson相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STATA3在卵巢癌和卵巢良性肿瘤中的阳性表达率比较

通过免疫组化分析，STAT3表达于细胞核和细胞质，主要表达于细胞核（图1，封三）。卵巢癌组织中阳性表达率明显高于卵巢良性肿瘤，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 Twist1在卵巢癌和卵巢良性肿瘤中的阳性表达率比较

免疫组化分析，卵巢癌组中Twist1蛋白表达于细胞核（图2，封三），阳性表达率为79.6%，明显高于卵巢良性肿瘤组织（28.6%），差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 STATA3和Twist1阳性表达率与卵巢癌FIGO分期的关系

晚期卵巢癌组织中STAT3、Twist1的阳性表达率均明显高于早期，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。提示，STAT3、Twist1的阳性表达与卵巢癌FIGO分期相关。见表2。

2.4 STAT3和Twist1在早期和晚期卵巢癌中的Pearson相关性分析

根据卵巢癌组织中STAT3和Twist1的阳性表达情况，采用Pearson相关性分析，结果显示两者表达在早期和晚期卵巢癌中均呈正相关（r = 0.653、0.798，均P < 0.05）。见图3。

3 讨论

迄今为止，卵巢癌的早期诊断仍无特殊方法，严重威胁着女性的身心健康。STAT3是STAT家族中的重要成员，负责将细胞因子、生长因子等胞外信号刺激传递到胞核特异性DNA片段，通过诱导靶基因转录发挥生物学效应[6-7]。通过对小鼠胚胎发育的动态分析，发现在STAT3缺陷的小鼠中，当胚胎发育至第6.5～7.5天时，胚胎的发育急剧退化，这表明STAT3的表达对早期胚胎发育至关重要[8]。然而，近年来，越来越多的研究聚焦于STAT3在肿瘤中所发挥的作用。在裸鼠的荷瘤模型中，STAT3信号通路的沉默可以抑制肿瘤细胞的增殖，促进凋亡和减缓肿瘤的生长[9]。在结肠癌等肿瘤中发现，患者预后与STAT3的表达水平密切相关[10-11]。本研究中，STAT3在卵巢癌中的阳性表达率高于卵巢良性肿瘤，差异有统计学意义，提示STAT3在卵巢癌的发生中发挥着重要作用。同时，STAT3在晚期卵巢癌中的阳性表达率明显高于早期，差异有统计学意义，提示卵巢癌临床分期越晚，STAT3蛋白阳性表达越高，STAT3蛋白的表达水平与卵巢癌的发展和恶化密切相关。

卵巢癌中90%以上为上皮源性肿瘤，其发生和发展与EMT的发生密切相关。EMT是由紧密连接、不能运动的上皮细胞通过程序化转变为具有连接疏松、迁移能力的间质细胞过程。分子水平主要为E-cadherin的降低和Vimentin、N-cadherin的表达增高；生物学上主要表现为与正常上皮极性相关的细胞骨架结构和介导细胞与细胞、细胞与间质之间连接的蛋白分布与表达的改变；行为学上体现为细胞黏附力下降，极性丢失，细胞由多边形向梭形转变，侵袭和迁移能力增强[12]。EMT不仅在胚胎发育过程中发挥着重要作用，而且影响着肿瘤的发生、侵袭和转移。早期癌细胞通过间质化改变细胞极性，获得更高迁移能力。晚期肿瘤细胞通过间质内皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET）重塑上皮表型，表达相关分子，介导癌细胞与组织接触并整合，从而形成转移灶[13]。Twist1作为EMT发生中的关键性转录因子，是近年来广受关注的致癌基因，其核苷酸和氨基酸序列高度保守[14]，其突变可导致胚胎发育异常和出生后发生染色体异常的塞-科综合征（Saethre-Chotzen syndrome，SCS）[15]。肿瘤中，Twist1通过直接与E钙黏蛋白启动因子上的黏“E-box”序列结合，抑制E钙黏蛋白的表达，使癌细胞紧密连接松弛，不断间质化，促使癌细胞粘连消失、形态改变和极性变化，最终介导EMT的发生[16]。研究证明[14，17-20]，Twist1基因的过表达不仅在乳腺癌、胃癌、肝癌等肿瘤的发生中发挥着重要作用，同时，其下调还能够抑制乳腺癌细胞的上皮间质转化能力，降低肿瘤细胞的迁移能力[21]。本研究中，Twist1在卵巢癌中的阳性表达率明显高于卵巢良性肿瘤，并且在晚期卵巢癌组织中的阳性表达率明显高于早期卵巢癌，差异均有统计学意义，提示Twist1不仅参与了卵巢癌的发生，而且还在卵巢癌的恶化中发挥着重要作用。endprint

大量研究表明，在一些恶性肿瘤中，Twist1的转录表达受STAT3调控。Hsu等[22]在胃癌患者组织的研究中表明，Notch/STAT3/Twist信号轴在肿瘤的形成过程中发挥着重要作用。Cheng等[23]通过STAT3-shRNA转染和STAT3-shRNA治疗STAT3增强剂处理的乳腺癌细胞，发现Twist基因是STAT3发挥生物学效应的转录靶点和基因锚点，证明了在乳腺癌发生和转移过程中STAT3/Twist信号轴的重要功能。Zhang等[24]研究也得出了相似的结论，并证明了活化的STAT3信号与Twist、E-cadherin表达相联系，并介导肝癌的侵袭与转移，异常的p-STAT3/Twist/E-cadherin信号轴可能导致肝癌患者预后差。本研究通过相关性分析，发现STAT3与Twist1在卵巢癌中的表达呈正相关，提示STAT3和Twist1蛋白关系密切，Twist1的表达可能受到STAT3的调控，进而介导EMT的发生。

总之，本研究通过对卵巢癌进行组织水平的研究，提示STAT3和Twist1作为两个致癌基因，其表达的失调直接影响着肿瘤的发生和发展，两者间具有密切的相关性，与其共同作为EMT的上游调控基因密不可分。因此，本研究为研究者们理解STAT3和Twist1在卵巢组织发生恶性生物学行为的持续表达中提供了有力依据，为卵巢癌的靶向治疗和研究提供了新思路。

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（收稿日期：2017-04-25 本文編辑：张瑜杰）endprint