曲古抑菌素A对抑郁模型大鼠行为及脑源性神经营养因子表达的作用研究

李昆+孙国平+卢豪忠

[摘要] 目的 探讨曲古抑菌素A对慢性不可预见性应激（CUMS）模型大鼠抑郁样行为及脑源性神经营养因子（BDNF）表达的调节作用。 方法 将40只成年雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、氟西汀组和曲古抑菌素A组。采用不同应激因子交替刺激加孤养复制CUMS模型；采用体重增长率、糖水偏嗜试验和旷场试验评估大鼠的行为学变化；采用Western blot测定大鼠海马组织中BDNF和磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）的表达水平。 结果 造模21 d后，模型组大鼠体重增长率、糖水偏嗜度、水平和垂直运动评分较正常对照组显著降低（P < 0.05）；氟西汀组和曲古抑菌素A组大鼠体重增长率、糖水偏嗜度、垂直和水平运动评分均较模型组显著增加（P < 0.05）。Western blot结果显示，模型组大鼠海马区BDNF和p-CREB表达水平显著低于正常对照组（P < 0.05），而氟西汀组和曲古抑菌素A组大鼠海马区BDNF和p-CREB表达水平显著高于模型组（P < 0.05）。 结论 曲古抑菌素A可有效改善抑郁模型大鼠的抑郁样行为，其抗抑郁作用可能与调节CREB-BDNF通路促进BDNF表达有关。

[关键词] 抑郁症；曲古抑菌素A；氟西汀；脑源性神经营养因子；环磷腺苷反应元件结合蛋白

[中图分类号] R749.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0025-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of Trichostatin A on behaviors and expression of brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in model rats with chronic unpredictable mild stress-induced depression （CUMS）. Methods Forty adult male SD rats were randomly divided into normal control group， model group， Fluoxetine group and Trichostatin A group. The model of depression was established with alternative unpredictable stress combining isolated living conditions. The rat ethological changes were assessed by body weight， sucrose consumption and open field test. The protein expressions of BDNF and phosphorylated cAMP responsive element binding protein （p-CREB） were measured by Western blot. Results After modeling for 21 days， the body weight， sucrose consumption， horizontal motion and vertical motion scores in model group were significantly lower than those of normal control group （P < 0.05）； however， these ethological indexes in Fluoxetine group and Trichostatin A group were obviously increased compared with those of model group （P < 0.05）. The results of Western blot showed that the expression of BDNF and p-CREB in model group were significantly lower than those of normal control group （P < 0.05）， while the expression of BDNF and p-CREB in Fluoxetine group and Trichostatin A group were significantly higher than those of model group （P < 0.05）. Conclusion Trichostatin A can effectively improve depression-like behaviors in CUMS model rats， its anti-depressive effect may be attributed to up-regulation of the CREB-BDNF signaling pathway.

[Key words] Depression； Trichostatin A； Fluoxetine； Brain-derived neurotrophic factor； cAMP response element-binding protein

抑郁癥是一种心境障碍性精神疾病，其病因和发病机制复杂，且发病率逐年升高，严重影响人类的精神健康和生存质量[1]。表观遗传学的研究为阐明抑郁症的发病机制和寻求新的治疗靶点提供了新的方向。组蛋白的乙酰化修饰是表观遗传学的重要组成部分，既往研究证实由组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）介导的组蛋白修饰在抑郁症的发生、发展过程中发挥重要作用[2]。HDAC6是HDACs ⅡB类成员，研究表明HDAC6在海马神经突触结构和功能可塑性方面起着重要的调控作用，并且抑制HDAC6活性可显著改善小鼠的抑郁样行为，这表明HDAC6有望成为治疗抑郁症的潜在药物靶点[3-4]。进一步研究显示，HDAC6调控神经突触重塑可能与调控转录因子环磷腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的磷酸化水平及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）的表达相关[5-7]。曲古抑菌素A是HDAC6的一种小分子选择性抑制剂，其在抑郁症中的药理作用研究鲜有报道。本研究以慢性不可预见性应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）模型大鼠为研究对象，通过观察其行为学的改变以及脑内相关蛋白的表达，对曲古抑菌素A的抗抑郁作用及其对海马CREB-BDNF信号转导通路的影响进行初步探讨。endprint

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，体重180～200 g，7～9周龄，由上海交通大学医学院实验动物中心提供（合格证号：中科动管第003号），自由进食饮水，实验前适应性饲养1周。1周后进行旷场实验评分，选取评分相近的大鼠40只，按随机数字表法将其分为四组：正常对照组、模型组、氟西汀组和曲古抑菌素A组，每组10只。

1.2 药物与试剂

曲古抑菌素A和盐酸氟西汀购自Sigma公司；磷酸化环磷腺苷反应元件结合蛋白（p-CREB）抗体、BDNF抗体和β-actin抗体购于Abcam公司；其他Western blot相关试剂均购自中国碧云天生物科技有限公司。

1.3 造模与给药

正常对照组每笼5只饲养，正常饮水进食，不给予任何刺激。其余各组采用CUMS结合孤养方法建立大鼠抑郁模型[8]。CUMS包含以下7种不同的刺激因子：①禁食24 h；②禁水24 h；③高速水平震荡5 min；④昼夜颠倒；⑤4℃冷刺激5 min；⑥45℃热刺激5 min；⑦夹尾5 min。每日随机给予一种应激刺激，相同刺激不连续出现，应激前10 min按分组（正常对照组：3 mL生理盐水；模型组：造模刺激+3 mL生理盐水；氟西汀组：10 mg/kg氟西汀；曲古抑菌素A组：25 mg/kg曲古抑菌素A）腹腔注射（ip）给药，连续21 d。

1.4 行为学评估

①体重增长率的测定：在实验第l天和第21天分别称取各组大鼠体重，计算体重增长率：体重增长率=（第21天体重-第1天体重）/第1天体重。②糖水偏嗜实验：在实验21 d后，当晚20：30禁水，第2天早上8：30给予每只大鼠等量的1%蔗糖水和纯水，测定每只大鼠1 h内蔗糖水和纯水消耗量，计算糖水偏嗜度：糖水偏嗜度=糖水消耗量/总液体消耗量×100%。③旷场实验：将大鼠放入100 cm×100 cm×60 cm的四壁黑色、底壁白色的无盖方箱内，底面由面积相等的100个方格组成。以大鼠穿越底面格子数为水平运动得分（每格计1分），直立次数为垂直运动得分（双足离开底面并放下双足计1分）。每只动物测定1次，每次5 min。

1.5 Western blot法测定海马组织中p-CREB和BDNF的表达

将大鼠断头处死后，于冰板上迅速分离两侧海马，超声匀浆后离心2次取上清液，BCA法进行蛋白浓度定量。10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，冰浴下转膜。室温封闭1 h后，加入一抗（p-CREB、BDNF和β-actin），稀释比例均为1∶1000，4℃下孵育过夜。洗膜，用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000稀释）室温孵育1 h，洗膜后加入ECL显影剂曝光。用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值作为蛋白表达水平的定量指标。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件（La Jolla，CA）进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 曲古抑菌素A对CUMS抑郁模型大鼠体重增长率的影响

实验结果显示，21 d后模型组大鼠的体重增长率较正常对照组显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；氟西汀组和曲古抑菌素A组的大鼠体重增长率较模型组显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；曲古抑菌素A组的大鼠体重增长率与氟西汀组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.2 曲古抑菌素A对CUMS抑郁模型大鼠糖水偏嗜度的影响

实验结果显示，与正常对照组糖水偏嗜度比较，模型组大鼠糖水偏嗜度明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，氟西汀组和曲古抑菌素A组大鼠的糖水偏嗜度均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；曲古抑菌素A组和氟西汀组大鼠的糖水偏嗜度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 曲古抑菌素A对 CUMS 抑郁模型大鼠旷场行为的影响

实验结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠水平运动和垂直运动得分均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，氟西汀组和曲古抑菌素A組水平运动和垂直运动得分均明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）；曲古抑菌素A组和氟西汀组大鼠水平运动和垂直运动得分比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.4 曲古抑菌素A对CUMS抑郁模型大鼠海马p-CREB表达的影响

实验结果显示，模型组海马p-CREB表达较正常对照组显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，氟西汀组和曲古抑菌素A组大鼠海马组织中p-CREB表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；曲古抑菌素A组和氟西汀组大鼠海马组织中p-CREB表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

2.5 曲古抑菌素A对CUMS抑郁模型大鼠海马BDNF表达的影响

为了进一步探究曲古抑菌素A对CUMS模型大鼠海马BDNF表达的影响，本研究采用Western blot检测了大鼠海马组织中BDNF的表达水平。结果显示：与正常对照组比较，模型组大鼠海马组织中BDNF的表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，氟西汀组和曲古抑菌素A组大鼠海马组织中BDNF表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；曲古抑菌素A组和氟西汀组大鼠海马组织中BDNF表达水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图5。endprint

3 討论

表观遗传学是指在核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达发生可遗传的变化。研究表明包括组蛋白乙酰化、DNA甲基化、miRNA及lncRNA调控在内的表观遗传学修饰在抑郁症中起着重要作用[9-10]。与核苷酸序列改变引起的疾病不同，表观遗传变异可通过相关药物予以逆转，因此，对表观遗传修饰进行深入研究在抑郁症的治疗中具有重要意义。既往研究表明，HDACs广泛性抑制剂如丙戊酸盐、丁酸盐及环庚烷异羟肟酸（SAHA）等可显著改善抑郁动物模型的抑郁样行为[11-14]。进一步研究发现，HDACⅡB类中的HDAC6在海马神经突触结构和功能可塑性方面起着重要的调控作用，并且特异性抑制HDAC6活性可显著改善小鼠的抑郁样行为。因此，研究和开发HDAC6抑制剂对于抗抑郁药物开发具有重要的研究意义[3-4]。本研究采用CUMS抑郁模型大鼠为研究对象，以临床一线抗抑郁药物氟西汀作为阳性对照，考察了HDAC6选择性抑制剂曲古抑菌素A对大鼠抑郁样行为的影响。实验结果表明，经过21 d的CUMS抑郁造模，模型组大鼠体重增长率和糖水消耗率降低，旷场试验中运动能力下降（P < 0.05）；而给予曲古抑菌素A治疗的大鼠体重增长率、糖水消耗率以及旷场试验中的运动能力较模型组比较显著改善（P < 0.05），且曲古抑菌素A在实验浓度下抗抑郁效果与氟西汀比较差异无统计学意义。这提示，曲古抑菌素A可显著改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁样行为，具有显著的抗抑郁作用。

CREB是一种核转录因子，CREB的转录调节功能受自身磷酸化的调节[15]。CREB在细胞核内以去磷酸化状态存在时没有转录活性，当细胞内环磷酸腺苷（cAMP）浓度升高激活蛋白激酶A（PKA）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等后可使CREB磷酸化为有转录调节活性的p-CREB[16]。cAMP-CREB通路与抑郁症密切相关，研究表明抑郁模型动物海马cAMP-CREB通路下调，抗抑郁治疗后可显著提高其海马区cAMP及p-CREB的蛋白表达[17]。表观遗传学的研究表明HDAC6可通过调控CREB影响神经突触重塑，这表明曲古抑菌素A的抗抑郁机制可能与调控CREB的磷酸化水平相关[6]。本研究采用Western blot检测了各组大鼠海马p-CREB的表达水平，结果显示应激抑郁大鼠海马组织中p-CREB表达下调，而曲古抑菌素A能显著逆转抑郁模型大鼠海马p-CREB的表达下调。

BDNF是cAMP-CREB通路介导抗抑郁治疗的重要靶标，BDNF因其在神经元结构和功能可塑性调节中的重要作用，被认为是抑郁症发生的多通路调节的交汇点，同时也是抗抑郁治疗的重要靶点之一[18-19]。研究发现抑郁症患者血清BDNF水平较正常人群显著下降，抗抑郁治疗可明显提高其血清BDNF水平[20]。动物实验表明，抑郁模型动物海马组织中的BDNF表达水平会发生显著下调，给予抗抑郁药物治疗后可明显提高海马组织中的BDNF表达水平[21-22]。为了探究曲古抑菌素A对海马BDNF表达的调控作用，本研究采用Western blot检测了实验各组大鼠海马区的BDNF表达水平。结果显示，模型组大鼠海马BDNF表达水平较正常对照组明显下调，氟西汀组和曲古抑菌素A组大鼠海马组织中BDNF表达较模型组明显升高，而氟西汀组和曲古抑菌素A组的BDNF表达水平差异无统计学意义。这提示曲古抑菌素A的抗抑郁样作用可能是通过增加CREB的磷酸化促进BDNF表达而实现的。

综上所述，本研究提示曲古抑菌素A能够显著改善CUMS 模型大鼠的抑郁样行为，进一步研究发现，曲古抑菌素A可能是通过调控CREB-BDNF通路而发挥上述抗抑郁样作用，在一定程度上为抗抑郁症新药物的开发提供了相关实验和理论依据，但其具体作用机制仍有待进一步研究。

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（收稿日期：2017-04-26 本文編辑：张瑜杰）endprint