杜仲总黄酮对小儿血管瘤内皮细胞凋亡的影响

李扬+刘国良+姚远

[摘要] 目的 研究杜仲總黄酮对小儿血管瘤内皮细胞凋亡的影响。 方法 体外培养小儿血管瘤内皮细胞，实验分为空白组（正常培养小儿血管瘤内皮细胞）；杜仲总黄酮高剂量组（50 μg/mL杜仲总黄酮处理小儿血管瘤内皮细胞）；杜仲总黄酮中剂量组（5 μg/mL杜仲总黄酮处理小儿血管瘤内皮细胞）；杜仲总黄酮低剂量组（0.5 μg/mL杜仲总黄酮处理小儿血管瘤内皮细胞），继续培养72 h后，MTT法检测细胞活力；TUNEL法检测细胞凋亡；Western blot法检测小儿血管瘤内皮细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase-9表达水平。 结果 与空白组相比，杜仲总黄酮中、高剂量组能够抑制小儿血管瘤内皮细胞增值，差异有统计学意义（P < 0.05）；杜仲总黄酮中、高剂量组细胞凋亡升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；杜仲总黄酮高剂量组Bax蛋白表达上升，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；杜仲总黄酮中、高剂量组caspase-9蛋白表达上升，差异有统计学意义（P < 0.05）；杜仲总黄酮低、中、高剂量组Bcl-2蛋白表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 杜仲总黄酮能够通过抑制Bcl-2蛋白表达、促进Bax和caspase-9蛋白表达，从而诱导小儿血管瘤内皮细胞发生凋亡，有望成为是一种有效的小儿血管瘤治疗剂。

[关键词] 杜仲总黄酮；小儿血管瘤；细胞凋亡；Bax；Caspase-9

[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0021-04

[Abstract] Objective To study the influence of Eucommia ulmoides oliver flavones （EUOF） on apoptosis of infantile hemangioma endothelial cell. Methods Infantile hemangioma endothelial cells were cultured in vitro. The cells was divided into blank groups （normal cultivate infantile hemangioma endothelial cells）， high dose group of EUOF （50 μg/mL EUOF treatment infantile hemangioma endothelial cells）， the middle dose group （5 μg/mL EUOF treatment infantile hemangioma endothelial cells）， the low dose group （0.5 μg/mL EUOF treatment children hemangioma endothelial cells）， then cultured for 72 hours， MTT method detected cell vitality. The TUNEL method detected apoptosis of cells； Western blot method detected expression levels of apoptosis related proteins Bax， Bcl-2 and caspase-9 in infantile hemangioma endothelial cell. Results Compared to the blank group， infantile hemangioma endothelial cell proliferation could inhibit in EUOF middle dose group， high dose group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The rate of apoptosis in high dosages group and middle dosages group rose， the differences were statistically significant （P < 0.05）； the expression of Bax in high dose group rose， differences were statistically significant （P < 0.01）. The expression of caspase-9 potein in the high dose group middle dose group and low dose group rose， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expression of bcl-2 in high dose group， middle dose group decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion EUOF can inhibit the the expression of Bcl-2 protein and promote the expression of Bax and caspase-9 in infantile hemangioma endothelial cells， that is expected to be an effective therapeutic agent in the disease of hemangioma.endprint

[Key words] Eucommia ulmoides oliver flavones； Hemangioma； Apoptosis； Bax； Caspase-9

血管瘤是婴儿最常见的良性肿瘤，在新生儿中发病率可高达10%[1]，女性发病率约为男性的3倍[2]。血管瘤是一种非常奇特的肿瘤，大多数血管瘤在生后1～3个月内出现，它可以在无任何治疗干预下自行消退，消退期一般在1～3年，最终消退率可达80%[3]。但仍约有20%的血管瘤由于生长部位特殊、生长迅速、破坏力强、损害组织脏器功能，甚至危及生命，必须进行必要的干预处理[4-5]。所以，血管瘤的治疗是一个不容忽视的问题，也是临床和科研研究的热点。近年来的研究表明，血管内皮细胞增殖活性和凋亡是小儿血管瘤增生、消退的病理组织学基础，而细胞凋亡是血管瘤自然消退的关键所在[6]。杜仲黄酮类提取物具有广谱抑菌、抗氧化、清除自由基和增强免疫力等作用，是众所周知的对健康有益产品，特别是对心血管疾病和癌症预防[7-8]。然而杜仲黄酮类提取物对血管瘤内皮细胞影响的报道较少，本研究观察杜仲黄酮类提取物对血管瘤内皮细胞增殖及凋亡相关蛋白的影响，从而为其开发成治疗血管瘤的药物提供一些理论支持。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

小儿血管瘤内皮细胞，购于上海博谷生物技术有限公司；Bax（批号：abs125423）、Bcl-2（批号：abs124378）、caspase-9（批号：abs119897）单克隆抗体、TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（批号：11684817910）均购于爱必信生物工程有限公司。

1.2 杜仲总黄酮提取及实验用药的制备

杜仲皮制成粉状（过60目筛），称取10 g，加60%乙醇200 mL，水浴回流60 min，过滤，提取2次，合并滤液，醋酸铅胺沉淀过滤，后过大孔树脂、聚酰胺和硅胶柱，过柱样品与标准品芦丁对照，测得总黄酮含量为65%。DMEM培养液制备总黄酮浓度分别为50、5、0.5 μg/mL的药液，调pH至7.0～7.2后过滤备用。参照曾超珍等[9]的方法。

1.3 小儿血管瘤内细胞的培养与实验分组

小儿血管瘤内皮细胞1×106个每孔接种于6孔板，培养在（DMEM）培养基、高温灭菌10%FBS，0.5%血清，1%的双抗（青霉素、链霉素），37℃ 5%二氧化碳湿润培养箱培养24 h达到80%融合时，将细胞为空白组（正常培养小儿血管瘤内皮细胞）；杜仲总黄酮高剂量组（50 μg/mL杜仲总黄酮100 μL处理小儿血管瘤内皮细胞）；杜仲总黄酮中剂量组（5 μg/mL杜仲总黄酮100 μL处理小儿血管瘤内皮细胞）；杜仲总黄酮低剂量组（0.5 μg/mL杜仲总黄酮100 μL处理小儿血管瘤内皮细胞），每组6个平行样本，重复3次。

1.4 MTT法细胞活力分析

选取无菌96孔板，96孔培养板内加入5×103～1×104个/mL单细胞悬液，每孔加入180 μL培养液，CO2孵箱中培养24 h并且加入倍比稀释成3种浓度的（0.5、5、50 mg/mL）各180 μL，孵箱中培养48 h后吸去上清液，每孔中加入MTT 20μL，继续培养4 h后加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，自动酶标仪测量各孔的吸光度值（A值）。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡

操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.6 Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白含量测定

杜仲总黄酮（0.5、5、50 μg/mL）加入小儿血管瘤内皮细胞基培养72 h后，收集细胞，Western blot法测定细胞中Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白的表达量。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 20.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析（ANOVA），用Tamhane′s法进行方差检验，LSD法和SNK法对数据进行两两比较。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 杜仲总黄酮对小儿血管瘤内皮细胞活力的影响

与空白组比较，杜仲总黄酮对小儿血管瘤内皮细胞生长有抑制作用，并呈剂量依赖性，其中高剂量组增值率为56%，中剂量组增值率为85%，差异有统计学意义（P < 0.05），低剂量组对小儿血管瘤内皮细胞活力无明显影响，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 杜仲总黄酮对小儿血管瘤细胞凋亡的影响

与空白组比较，杜仲总黄酮高、中剂量组细胞凋亡数量明显上升，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。杜仲总黄酮低剂量组凋亡率无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1、表2。

2.3 杜仲总黄酮对小儿血管瘤细胞Bax、Bcl-2、caspase-9表达的影响

与空白组比较，杜仲总黄酮高剂量组Bax表达上升，差异有统计学意义（P < 0.05），中、低剂量组无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。杜仲總黄酮高、中、低剂量组Bcl-2蛋白表达明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05），其中高剂量组效果最明显。杜仲总黄酮高中低剂量组caspase-9表达明显上升，差异有统计学意义（P < 0.05），其中高剂量组效果最明显。见图2。

3 讨论

杜仲，又名“木棉”，属杜仲科落叶乔木，为我国特有的经济树种。杜仲含许多药用有效成分，如生物碱、黄酮类、维生素、氨基酸等，具有消炎抑菌、抗衰老、抗癌等诸多功效，现代研究表明：杜仲黄酮具有抗自由基、抗氧化、抑菌、抗病毒等作用[10]。杜仲中富含的黄酮类物质，是大多数氧自由基的清除剂，可以提高的活力，减少及的生成，它可以增加冠脉流量，对实验性心肌梗塞有对抗作用；对急性心肌缺血有保护作用；对治疗冠心病、高血压等疾病有显著效果，并且有抗菌消炎的作用，但杜仲黄酮类对小儿血管瘤细胞的凋亡作用研究却少有报道。endprint

细胞凋亡是多细胞有机体为了调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。细胞凋亡参与机体许多病理生理过程。Bcl-2 基因家族在控制细胞凋亡过程中起着重要的作用，该家族包括抑制凋亡的基因 bcl-2 和bcl-xL，以及促进凋亡基因Bax和 bad[11-12]。它们具有同源的氨基酸序列。Bax的過表达已经证明可以促进细胞的死亡，bcl-2是一种抑制细胞凋亡蛋白，在人类肿瘤的发生、发展中起着重要作用[13-14]。本研究显示与空白组相比，杜仲总黄酮高剂量组Bax表达上升，中、低剂量组无明显变化（P > 0.05），而杜仲总黄酮高、中、低剂量组Bcl-2蛋白表达明显下降（P < 0.05），其中高剂量组效果最明显，说明杜仲总黄酮的剂量对细胞凋亡因子的影响是关键，为了治疗效果更佳明显应该选择高剂量用于后期实验研究。

caspase家族是执行细胞凋亡的关键酶家族，caspase-9 作为其中一员，属于该家族的凋亡起始组，其活化可以激活凋亡效应组的 caspase-3 和caspase-7，从而诱导细胞凋亡[15-16]。而caspase-3和caspase-9 之间存在正反馈效应，可使细胞凋亡加速[17-19]。血管内皮细胞的增殖与凋亡是维持血管内径的重要因素，这种平衡的打破，就会导致血管的畸形[20-21]。本研究显示与空白组相比，杜仲总黄酮高、中剂量组caspase-9表达上升，差异有统计学意义（P < 0.05），其中高剂量组效果最明显。低剂量组无明显变化，差异无统计学意义（P > 0.05），说明杜仲总黄酮对caspase-9表达具有影响作用，这种作用成剂量依赖性。

本研究证实杜仲总黄酮可以在体外以剂量依赖性的方式诱导血管瘤内皮细胞发生凋亡。这种凋亡可能是下调bcl-2表达，上调Bax、caspase-9表达而起作用，因此杜仲总黄酮是一类具有开发作为治疗血管瘤的原料药。

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（收稿日期：2017-04-30 本文编辑：苏 畅）endprint