RSV感染幼龄大鼠肺组织TSLP与Th2反应的相关性分析①

曲百娜 黄 燕 崔振泽 徐 超

(大连市儿童医院,大连116000)

RSV感染幼龄大鼠肺组织TSLP与Th2反应的相关性分析①

曲百娜 黄 燕 崔振泽 徐 超

(大连市儿童医院,大连116000)

目的：通过观察当呼吸道合胞病毒(RSV)感染幼龄大鼠肺组织时胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)与IL-4、IL-10和IL-13的变化，探讨TSLP与Th2反应的相关性。方法：将18只正常Wistar大鼠随机分为模型组和正常对照组，每组各9只。应用RSV病毒液滴鼻造模，生理盐水滴鼻做对照。取大鼠肺部组织进行病理切片观察炎症反应情况；运用实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)分别检测两组大鼠不同时间点合胞病毒载量情况和肺组织TSLP在基因水平的表达情况，同时采用免疫印记法(Western blot)检测肺组织TSLP在蛋白水平的表达情况；同时应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中Th2型相关细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的表达水平；并对TSLP与L-4、IL-10、IL-13的关系进行Spearman相关分析。结果：与正常对照组相比，模型组大鼠在滴鼻感染后出现精神状态差、毛粗糙、活动减少、呼吸短促等症状，且上述症状进行性加重；病理观察显示模型组大鼠可见肺泡壁明显增厚，肺间质可见大量的浆细胞、淋巴细胞以及嗜酸性粒细胞浸润；q-PCR法检测模型组大鼠合胞病毒载量逐渐增加，在第5天左右达到峰值，后逐渐降低；RSV感染促进大鼠体内TSLP表达水平增加,q-PCR法和Western blot法检测显示：模型组大鼠的TSLP浓度均高于对照组(P<0.05)；同时ELISA检测表明模型组大鼠血清中IL-4、IL-10和IL-13的浓度均高于对照组(P<0.05)；Spearman相关分析显示RSV模型组大鼠的TSLP与IL-4和IL-10表达水平均呈正相关，TSLP与IL-13表达水平无相关性。结论：RSV感染Wistar大鼠肺组织时，可诱导TSLP表达水平增加，同时促进Th2型炎症反应的发生及相关细胞因子的表达，为进一步研究RSV感染致毛细支气管炎和哮喘等喘息类疾病的作用机制及临床治疗奠定了基础。

呼吸道合胞病毒(RSV)；胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)；Th2反应

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)是引起婴幼儿毛细支气管炎、哮喘等喘息类疾病的重要病原体。在国内外，RSV感染对年龄在5岁以下儿童的致病率、住院率及死亡率均较高，但我国由RSV引起急性下呼吸道感染的死亡率更高[1]。目前为止，我们对RSV感染如何引起急性喘息类疾病，并在日后逐渐发展为哮喘的机制尚未完全了解。最近的研究已经表明RSV感染刺激气道上皮细胞(Airway epithelial cell,AEC)产生TSLP[2]。同时Liu等[3]研究发现TSLP能刺激树突状细胞(Dendritic cell，DC)成熟，刺激初始CD4+T 淋巴细胞增殖，并诱导其向Th2 方向分化，产生相关细胞因子，加重Th2 炎症反应，从而导致喘息类疾病的发生发展。本研究通过建立RSV感染Wistar大鼠肺组织模型，观察RSV感染对大鼠肺组织TSLP表达水平的影响及Th2反应变化情况，并探讨TSLP与Th2反应的相关性，为临床防治RSV感染所致病理损伤提供有力依据，为实现早期有效预防儿童喘息类疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂

1.1.1实验对象 18只Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，鼠龄均3周左右，体重(30±10)g，由辽宁本溪长生生物技术有限公司提供，大鼠均置于清洁无病原体的鼠笼内饲养，饲料和饮用水均经过高温高压消毒处理。

1.1.2病毒来源 RSV Long株，来源于中国预防医学科学院病毒所毒种室，冻存于-80℃冰箱，测定大鼠病毒半数致死量LD50为102ml-1。

1.1.3仪器与试剂 7500 Real-time PCR仪(美国Applied Biosystems)；Nano2000型超微量紫外分光光度计、低速冷冻离心机(美国，Thermo)；电泳仪(DYY-10C)；MicroChemi化学发光成像系统(Micro Chemi4.2)； Real-time PCR 试剂盒(DRR047A，DRR820A， TaKaRa宝生物工程有限公司)；TSLP试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)； IL-4、IL-10、IL-13试剂盒(美国R&D Systems公司)

1.2研究方法

1.2.1动物模型制作和分组 依据随机数字表法，将18只正常Wistar大鼠分为正常组和RSV模型组，每组9只。RSV模型组在乙醚麻醉下经鼻腔接种RSV Long株病毒液，0.1 ml/只，正常组在同等条件下接种等量不含病毒的生理盐水，每日1次，连续接种3 d。所有大鼠均在同一条件下饲养，正常饮食，自由饮水。

1.2.2取材方法 于第7天分批次处死各组大鼠并进行取材，取眼球血后置于促凝管内促凝，离心后取上层清液，收集血清，待ELISA法检测；处死取材，无菌条件下取左肺置于装有Trizol的EP管中，以备进行RT-PCR检测；取右肺放入无菌生理盐水中洗涤2次，用于肺组织病理观察及Western blot检测。

1.2.3肺组织病理观察方法 新鲜大鼠肺组织经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色等处理，中性树胶封片，观察各组大鼠肺组织炎症变化情况。

1.2.4实时荧光定量PCR(qPCR)检测肺组织RSV、TSLP mRNA的表达 Trizol提取各组大鼠肺组织总RNA，并测定RNA的浓度和纯度。引物序列如下：actin: 上游引物5′-TGGCACCCAGCA-CAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′(186 bp)；RSV: 上游引物5′-TCCCATTGATFTCTTFACCA-3′，下游引物5′-CCAACGGAGCACAGGAGATA3′(548 bp)；TSLP：上游引物5′-AAATCCAGAGCCTAACCTTCAATC-3′,下游引物5′-CTTCATTGAGTAGCATTTATC-3′(143 bp)。

基因组DNA去除体系如下：经试剂处理后取5 μl RNA原液，用DEPC水将其稀释至200 ng/μl混匀。在PCR仪上反应，条件为42℃ 2 min；RT反应体系如下：去除基因组DNA的总RNA，经试剂处理后在PCR仪上反应，条件为①37℃ 15 min；②85℃ 5 s；最后进行PCR扩增反应，在PCR反应管中先加入PCR扩增反应液，然后在每个反应管中加入cDNA， PCR仪中Real-time PCR反应条件为；①95℃ 2 min；②95℃ 30 s；③60℃ 30 s，40个循环。反应结束后进行溶解曲线分析，以鉴定PCR产物的特异性。采用2-ΔΔCt法换算样品中RSV、TSLP mRNA 相对表达量。

1.2.5Western blot检测肺组织TSLP蛋白含量 取出冻存的肺组织制备匀浆，提取蛋白，测定蛋白浓度后，保存于-20℃待用。取50 μg的蛋白样品于12% SDS-PAGE凝胶中进行电泳，待目的蛋白接近凝胶底部时停止电泳，4℃、120 V恒压电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入抗AQP1(1∶1 000)抗体，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(1∶1 000)室温孵育1 h后发光显色，凝胶成像系统照相。实验结果采用Image J软件分析，扫描灰度值，TSLP的蛋白水平通过其Western blot曝光条带亮度与GAPDH相应条带亮度比值来确定。

1.2.6ELISA检测血清中IL-4、IL-10、IL-13含量 严格按照说明书步骤用ELISA试剂盒检测IL-4、IL-10和IL-13浓度。

2 结果

2.1一般情况 正常组大鼠精神状态好，反应灵敏，皮毛柔顺有光泽，呼吸频率、活动、进食、饮水均正常，体重逐渐增加；RSV模型组大鼠精神状态差，反应迟钝，活动少且缓慢，毛色无光泽，呼吸频率加快，进食、饮水严重减少，体重严重减轻。

2.2各组大鼠肺脏病理改变 正常组大鼠支气管、肺组织结构完整，支气管黏膜上皮完整，未见明显炎性细胞浸润，肺泡壁无增厚，无充血。RSV模型组大鼠可见肺泡壁明显增厚，肺间质可见大量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性细胞浸润(图1)。

2.3两组大鼠病毒载量情况 模型组大鼠合胞病毒载量逐渐增加，在第5天左右达到峰值，后逐渐降低(表1)。

图1 正常组与模型组大鼠肺脏病理表现(HE染色，×200)Fig.1 Lung pathological manifestations of normal group and model group(HE staining,×200)

2.4各组大鼠肺组织TSLP mRNA含量情况及蛋白表达水平 于实验第7天，经q-PCR和Western blot检测两组大鼠肺组织中TSLP的表达量，结果见表2。结果显示，RSV模型组大鼠的肺组织中两种检测方法的TSLP表达量均高于正常组(P<0.05)。

2.5ELISA法检测各组大鼠血清中细胞因子表达水平 于实验第7天，经ELISA检测两组大鼠血清中IL-4、IL-10和IL-13细胞因子的含量，结果见表3。结果显示，RSV模型组大鼠血清中细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的含量均高于正常组(P<0.05)。

2.6TSLP与细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的相关性分析 研究结果显示，RSV模型组大鼠的TSLP与IL-4呈正相关(r=0.097,P=0.012<0.05)、与IL-10呈正相关(r=0.886,P=0.019<0.05)、与IL-13无相关性(r=0.665,P=0.149>0.05)(图2)。

表1两组大鼠不同时间点合胞病毒载量情况

Tab.1Twogroupsofratsatdifferenttimepointsofsyncytialvirusloadsituation

GroupsSyncytialvirusloadDay3Day5Day7Control---Model2.37±0.074.58±0.211.26±0.04

GroupsDetectionmethodPCRWBControl0.66±0.150.42±0.07Model1.08±0.30.97±0.1t-3.064-13.697P0.0120.000

GroupsCytokinesIL-4IL-10IL-13Control17.17±2.064.42±0.495.20±0.95Model26.01±6.116.52±2.537.92±2.69t-4.108-2.436-2.864P0.0020.0390.017

图2 TSLP与细胞因子IL-4、IL-10和IL-13的相关性Fig.2 Correlation between TSLP and cytokines IL-4,IL-10 and IL-13

3 讨论

众所周知，早期因RSV感染致毛细支气管炎的患儿，在其随后的生活中发生反复喘息并演变为哮喘的可能性明显增加。有研究表明RSV感染可诱发大量炎症细胞、炎症因子及炎症介质的释放，在气道免疫炎症损伤过程中起着重要的作用，并可最终诱发喘息类疾病[4]。其中TSLP为喘息类疾病的关键因子，其在RSV感染中的变化在本实验中得到了证实。本实验以RSV感染的幼龄大鼠为模型进行研究，发现与正常组相比，模型组大鼠在滴鼻感染后出现精神状态差、毛粗糙、活动减少、呼吸短促等症状，且上述症状进行性加重，病理观察可见肺泡壁明显增厚，肺间质可见大量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性细胞浸润，且模型组大鼠合胞病毒载量逐渐增加，在第5天左右达到峰值，后逐渐降低，提示RSV感染可诱导气道炎症损伤。更为重要的结果显示RSV感染幼龄大鼠时，检测其肺组织无论是蛋白水平还是基因水平TSLP含量较正常组比较均显著增加(P<0.05)，提示RSV感染可促进机体中TSLP的表达。有研究已表明RSV感染能刺激AEC中的RIG-I和TLR3以产生TSLP，其是一种可促进过敏性炎症和哮喘发生，并由上皮细胞分化的IL-7样细胞因子[5,6]。而RSV感染致TSLP表达水平增加的可能机制为TLR3与RSV感染机体后形成的dsRNA结合后的产物可活化胞内区的两个酪氨酸残基[7]，使其发生磷酸化，并招募和活化RIP1和TRIF,前者直接激活NF-κB通路，后者通过活化TRAF6激活NF-κB通路；最终促进TSLP表达增加。

在健康个体中Th1以及Th2保持动态平衡，当感染RSV时，这种平衡被打破，从而导致机体致病。有研究证实哮喘患者气道内CD4+T细胞增多，尤其是Th2细胞，而IL-4、IL-10和IL-13又为Th2细胞分泌及反应的主要细胞因子[8]。本研究结果也表明RSV感染幼龄大鼠肺组织时可诱导IL-4、IL-10和IL-13表达水平增加，提示RSV感染可促进Th2炎症反应的发生及相关细胞因子的表达，同时本研究结果也显示，RSV模型组大鼠的TSLP与IL-4表达水平呈正相关(r=0.097，P=0.012<0.005)与IL-10表达水平均呈正相关(r=0.886，P=0.019<0.05)，与IL-13表达水平无相关性(r=0.665，P=0.149>0.05)，提示TSLP与Th2反应存在相关性。这与国外许多学者开展的动物实验及临床研究结果相一致，即TSLP活化的DC可随淋巴循环到达局部淋巴结，抑制Th1反应，促进Th2反应，且Th2细胞又可通过分泌IL-5影响骨髓内嗜酸性粒细胞的分化，分泌IL-4、IL-10和IL-13驱使B细胞分泌IgE,从而在变态反应性疾病中起到重要作用[5,8-13]。而TSLP活化Th2反应并刺激其相关细胞因子增加的可能机制为TSLP通过激活抗原递呈细胞DC，促进髓样树突状细胞(mDC)表达OX40L，并形成OX40/OX40L复合物，同时mDC增强的胸腺激活调节趋化因子配体17(TARC)可协同OX40/OX40L复合物诱导CD4+T细胞增殖，同时向Th2方向分化，并诱导Th2相关细胞因子IL-4、IL-10和IL-13 的表达，增强Th2炎症反应，从而导致喘息类疾病的发生发展[3,14-18]；同时也能刺激活化的T细胞分化为记忆T细胞，加强对再次感染产生的免疫应答。更有研究表明由Th2分泌的细胞因子IL-4，能协同入侵上皮细胞并进行自我复制的RSV病毒合成物——dsRNA刺激气道上皮细胞生成TSLP，以此看来，这一负反馈环给机体造成了持续而严重的损伤。

我们的研究表明RSV感染大鼠肺组织时，可诱导机体高水平表达TSLP，而TSLP又可通过诱导CD4+T细胞向Th2方向分化，进一步刺激Th2类细胞因子的分泌，加强炎症反应，增加气道高反应性，从而诱发喘息类疾病。本研究为进一步科研及临床研究提供了实验基础，但关于RSV感染患儿体内TSLP水平和Th2反应如何变化，以及TSLP与Th2反应有何相关性，仍需进一步研究。

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[收稿2017-04-14 修回2017-06-06]

(编辑 张晓舟)

CorrelativeanalysisofTSLPandTh2responsesinlungtissueofyoungratsinfectedwithRSV

QUBai-Na,HUANGYan,CUIZhen-Ze，XUChao.

DalianChildren′sHospital,Dalian116000,China

Objective:To investigate the changes of thymic lymphocyte procyanidin(TSLP)and interleukin-4(IL-4),interleukin-10(IL-10)and interleukin-13(IL-13)in the lung tissue of young rats infected with respiratory syncytial virus,and to investigate the changes of TSLP and Th2 Correlation.Methods:18 Wistar rats were randomly divided into RSV infection group and normal group,9 rats in each group.Application of RSV virus droplets nasal modeling,saline diarrhea as a control.The lung tissue of rats was taken for pathological observation；the load of syncytial virus at different time points and the expression of TSLP in lung tissue were detected by Real-time quantitative polymerase chain reaction(q-PCR)；at the same time,the expression of TSLP at the protein level was detected by Western blot.The levels of cytokines IL-4,IL-10 and IL-13 in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).And the relationship between TSLP and IL-4,IL-10 and IL-13 was analyzed by Spearman correlation.Results:Compared with the normal control group,the rats in the model group showed symptoms such as poor mental state,rough hair,decreased activity and shortness of breath after intranasal infection,and the symptoms were aggravated.Pathological observation showed that the alveolar wall was thickened in the model group,and a large number of lymphocytes,plasma cells,eosinophil infiltration.q-PCR was used to detect the syncytial virus load in model group,and reached the peak at about 5 days,then decreased gradually.RSV infection increased the secretion of TSLP in rat respiratory tract.q-PCR and Western blot showed that TSLP concentration in model group was higher than that in control group(P<0.05).The levels of IL-4,IL-10 and IL-13 in the serum of the model group were higher than those in the control group(P<0.05).Spearman correlation analysis showed that TSLP was positively correlated with IL-4 and IL-10 expression in RSV model group,and there was no correlation between TSLP and IL-13 expression.Conclusion:RSV infection in rat lung tissue can induce increased expression of TSLP,while promoting the occurrence of Th2 type of inflammatory response and the expression of related cytokines,in order to further study of RSV infection caused by bronchiolitis and asthma and other respiratory diseases,the mechanism of action and clinical treatment laid the foundation.

Respiratory syncytial virus(RSV);Thymic stromal cell line(TSLP);Th2 reaction

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.019

①本文受国家自然科学基金(No.81473726)和辽宁省自然科学基金项目(2014020173)资助。

曲百娜(1990年-)，女，在读硕士，主要从事小儿呼吸系统疾病的研究，E-mail:bainalove@sina.com。

及指导教师：崔振泽(1964年-),男,博士，教授,硕士生导师,主要从事中西医结合防治小儿呼吸系统疾病研究,E-mail:cuizhenze@126.com。

R392.9

A

1000-484X(2017)09-1366-05