亚洲百合不定芽的诱导及再生植株的建

立蒋瑶+陈文波+蒋炷宇

摘要：以亚洲百合鳞茎为外植体，采用不同浓度激素组合对其进行不定芽的诱导、增殖以及生根进行研究，以期建立该种亚洲百合组织培养快速繁殖体系。试验结果表明：诱导亚洲百合不定芽的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，其出芽率为83.33%，最适宜诱导不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其增殖率为92.75%，诱导生根的最佳培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L，其生根率为92.86%。试验结果可为亚洲百合生产扩繁、脱毒复壮、基因转化等工作提供参考。

关键词：亚洲百合；不定芽诱导；增殖；鳞片；培养基

中图分类号： S682.2+65.04文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0035-04

E-mail：jiangyao0221@163.com。百合是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）多年生草本植物，大多数品种性喜凉爽、湿润的半阴环境，较耐寒冷，具有重要的经济价值和应用价值。据调查，百合有47种18个变种，中国特有种为36种15个变种，分布遍及全国各地[1]，百合又是切花系列中主流产品，其切花主要包括3类：亚洲百合系列、东方百合系列、康香百合系列[2]。亚洲百合（Lilium asiatic Hybrids）属百合科百合属植物，其栽培品种由卷丹、垂花、朝鲜百合等多个亚洲原种的杂交或实生选种选育而来，不耐高温，性喜冷凉湿润气候、半阴环境，具有食用、药用、提取香料等多种用途[2]。百合以扦插、分株和分球等无性繁殖方式为主[3]，繁殖系数低，容易感染病毒，导致品种退化；目前百合鳞茎[4-6]、叶片[7]、茎尖[8]、花器官[8-9]、胚[10]等不同组织或器官的组织培养已获得成功，建立了部分基本的组培快繁技术体系[11-13]可在短时间内获得大量的无病毒、优质种苗[14-16]。

近年来，国内外开展亚洲百合的研究主要集中在细胞生物学、引种栽培、组织培养、遗传育种等方面，从2001年开始选用亚洲百合为母本，采用4种授粉方法解决百合自交不亲和性和种间不亲和性[17]，亚洲百合顶级×金色号角杂交后通过胚培养技术分离发育不良的胚[18]，亚洲百合和铁炮百合采用切割花柱授粉和子房授粉结合胚培养进行正反杂交，可克服杂交障碍，从而提高获得杂种胚的概率[19]，亚洲百合种间或种内也是通过类似的方法进行杂交，提高坐果率，从而使杂交组合亲和性也提高[20-21]。对国外各引进11个不同的亚洲百合品种进行相关农艺性状调查，并采用层次分析法进行评价，结果刁义维等发现Black Out、Cheops、Navona、Mount Duckling等4个新品种适宜北方地区栽种[22]，而董航等认为Strawberry and cream、Tiger player和Dot.com等3个新品种适宜北方地区栽种[23]，由此说明，通过引进和筛选不同亚洲百合能够丰富其品种多样性。利用农杆菌介导法，GsZFP1基因在亚洲百合耀眼小鳞片中能够表达，提高其抗寒、抗旱性[24]。赵庆芳等[25]采用不同種类和浓度的保鲜溶液对东方百合和亚洲百合切花后进行保鲜研究，认为蔗糖30 mg/L+8-HQS 200 mg/L为最佳保鲜剂。

目前亚洲百合组织培养相关报道并不多见，其组培主要以鳞片[26-27]为主，以及花器官的不同部位[28-30]、叶片[31]等为外植体进行器官发生途径进行探讨，以及后期试管苗生根移栽[32-33]等方面的研究。由于亚洲百合优质种球大多数依靠进口，其鳞茎繁殖多代后易感病，从而引起该品种退化或种间杂交不亲和性等问题，严重制约其市场需求，故本研究以亚洲百合（Brunello）鳞茎（从沭阳县引种种于凯里学院环境科学与生命科学学院实验地）为试验材料，采用不同浓度激素配比对其进行初代培养、继代培养、生根培养等研究，以期建立亚洲百合组织培养再生体系，进一步为亚洲百合生产扩繁、脱毒复壮、基因转化等工作奠定基础，旨在为种苗繁育及产业发展提供理论依据，以期培育更多新品种。

1材料与方法

1.1试验材料

选用亚洲百合（Brunello）为试验材料，从沭阳县将亚洲百合引种于凯里学院环境科学与生命科学学院实验地，进行相关的日常管理（整地、种植、浇水、除草），选用亚洲百合健壮、无病虫害鳞茎为试验材料（图1）。

1.2试验方法

1.2.1外植体的消毒从实验地采集亚洲百合鳞茎（去除最外1层），清除表层泥土，剥开后采用自来水冲洗2 h，选用中外层进行接种。外植体先用70%乙醇处理30 s，无菌水冲洗3次，再用0.1% HgCl2处理10 min，无菌水冲洗5次，滤纸吸干备用。

1.2.2不定芽的诱导不定芽诱导以MS为基本培养基，添加不同浓度激素配比的6-BA和NAA，随机组合为9个处理（表1），每个处理接种30个外植体，每个处理重复3次。随机选择鳞片中下部位并切成约0.5 cm×0.5 cm大小方块（形

1.3培养条件

培养温度为25 ℃，培养时间为光照时间16 h/d，暗培养时间8 h/d，且光照度为2 000 lx。

2结果与分析

2.1不同激素对亚洲百合形成不定芽的影响

取亚洲百合鳞茎的中下部位接种于诱导不定芽的不同培养基中，其形态初始为乳白色（图2-A），逐渐变浅黄，6～9 d再由浅黄转绿（图2-B），15 d左右在绿色的鳞片块上开始出现浅绿色球状突起，呈小球状，之后继续增大，这些突起继续生长7 d左右突起逐渐分化成绿色小芽，部分还有不定根伸出（图2-C）。

由表1可知，采用不同激素浓度配比均能从鳞片诱导出不定芽，且污染率均低于27.00%，表明不同处理间存在差异，其中2、5、6号3个处理的诱导率均高于60.00%，而2号处理的诱导率最高，为83.33%，其鳞片均有转绿，大多数均长出不定芽且生长状况优良，5号和6号处理诱导率分别为64.00%和70.83%，其鳞片大多数返绿，不定芽长势较好；4号处理其诱导率为56.00%，诱导的不定芽相对较小，生长较慢，颜色较浅；其他各处理不定芽诱导率均低于50%，诱导的不定芽也较弱小，生长缓慢。由此可知，6-BA浓度为 1.0～1.5 mg/L，促进不定芽的诱导，当6-BA浓度升高至 3 mg/L 时，对不定芽诱导效果较差。根据各个处理出芽的速度以及不定芽的长势和数量，能够判定2号处理即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L适合该种亚洲百合不定芽的诱导，符合分裂素/生长素浓度比值高，利于诱导不定芽的规律。endprint

2.2不同激素对亚洲百合不定芽增殖的影响

将初代培养得到的健壮不定芽转接到不同增殖培养基中，不定芽初始相对较小，颜色较浅（图3-A），5 d后开始慢慢变大且颜色变绿（图3-B），经15 d后，发现不同处理不定芽四周均有浅绿色的突起产生，继续生长10 d左右逐渐分化成绿色小芽，而后继续生长变大，同时也有部分有不定根生长（图3-C）。结果表明，不同激素配比处理后增殖的不定芽（个数）均有所增加，且生长相对茁壮，其增殖率均高于50%，污染率低于8%，且不同处理间存在差异。由表2可知，不同处理不定芽增殖有所差异，其中1、4、5号等3个处理的增殖率均高于60%，且4号处理的增殖率最高，为9275%，其不定芽的长势良好；其余处理的增殖率均低于60%，且其不定芽相对较为弱小。由此表明，1、4、5号处理的6-BA浓度范围为 0.8～1.0 mg/L时，随着6-BA浓度的增加，分化芽的数量依次增加，出芽数也增多，之后浓度升高后，出芽增殖数相对减少；NAA浓度范围为0.1～0.2 mg/L时，随着NAA浓度升高，不定芽增殖数量逐渐减少，高浓度NAA对不定芽增殖有抑制作用。根据不同处理不定芽增殖出芽的速度以及不定芽的长势和数量，可以确定处理4即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L 配方的增殖率最高，达到9275%，其不定芽生长健壮且颜色葱绿，分裂素/生长素比例相对较高，有利于不定芽的增殖。

2.3不同激素对亚洲百合生根的影响

将增殖培养得到的健壮无根组培苗转入9种不同处理生根培养基中，5～7 d后可见小鳞茎的基部能够长出毛状的白根，21 d后长出的根系发达且粗壮，在不定根的四周能观察到有细小的白毛生长，约30 d后几乎所有的组培苗都会长出不定根（图4）。

不同激素浓度配比对亚洲百合鳞茎均都能诱导不定芽生根，由表3可知，1～9号处理生根率都高于58%，且污染率相对较低，低于11.00%，其中2号处理生根率最高，达9286%，其余处理的生根率均在58%～76%之间，培养期间生根较慢，不定根细小且数目较少，生长一般，由此表明，随着MS中大量元素的升高，生根效果较差，仅有1/2MS为最佳培养基，添加一定的低浓度NAA促进生根，2号处理即 1/2MS+NAA 0.2 mg/L生根率最高，其不定根粗壮，根系发达，生长较快，数目较多且长势良好。由此表明，1/2MS为生根最适培养基，而生长素NAA较低的浓度有利于生根培养。

3结论与讨论

通过本次试验研究可知，亚洲百合（Brunello）诱导分化不定芽的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，最适宜诱导不定芽增殖的培养基为MS+6-BA 10 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导不定芽生根以1/2MS+NAA

0.2 mg/L为最佳培养基，其诱导率、增殖率和生根率分别为83.33%、92.75%和92.86%。

3.1激素浓度对不定芽诱导的影响

选用鳞片为外植体的不同研究表明，不同亚洲百合品种诱导不定芽存在一定的差异，通过对黄百合[34]、金百合[34]、普瑞头[35-36]、布耐罗[35]、红色警报[36]、精粹[37]等多种亚洲百合鳞片为外植体诱导不定芽的试验比较发现，不同亚洲百合品种因材料和生长周期不同，从而导致诱导分化所需用激素浓度存在差异，6-BA浓度在0.5～2.0 mg/L范围内，有利于不定芽分化和生长，超过一定范围后，会抑制不定芽的生长，NAA在0.1～0.5 mg/L浓度范围内，促进不定芽生长。

本试验结果表明，该种亚洲百合选用鳞片为外植体进行不定芽诱导的最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，其诱导不定芽的出芽率为83.33%，与周蕴薇的研究结果[22]基本一致。

3.2激素浓度对不定芽增殖的影響

亚洲百合增殖大多选用MS为基础培养基，选用6-BA和NAA不同激素浓度配比进行研究，本试验研究结果表明，最适宜诱导不定芽增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其诱导不定芽的增殖率为92.75%，这与孙红梅等[30]和王晶[7]的研究结果一致。

其他研究中以多安娜（♀）和普瑞头（♂）的杂交后代无菌苗进行不定芽诱导增殖的最适激素配比6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L[2]。大多数亚洲百合在选用鳞片进行不定芽增殖过程中，不同品种间存在差异，黄百合和金百合[34]、布耐罗[35]、红色警报[36]以及金色号角[38]最适不定芽增殖 6-BA 浓度范围为0.5～3.0 mg/L，NAA浓度0.1～1.0 mg/L，同一普瑞头[39-40]品种诱导不定芽增殖也有所不同，由此表明，亚洲百合增殖过程中通过6-BA和NAA不同激素浓度配比，尤其是较高浓度的6-BA促进不定芽增殖，较低NAA浓度有利于不定芽的生长和膨大。

3.3激素浓度对生根的影响

前人研究不同亚洲百合品种生根培养过程中发现，金色号角[38]无需添加生长素浓度则生根效果最佳，其他品种[18，34，37]则需加入NAA不同浓度，其范围为0.05～0.5 mg/L；同一品种普瑞头[39-40]诱导生根培养的基础培养基存在差异，选用IBA和NAA等2种不同生长激素，但其浓度均为0.5 mg/L，由此说明，一定浓度的生长素有利于不定芽的生根，但红色警报最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.3 mg/L[37]。

本试验主要选择3种不同的基础培养基，同时选用IBA和NAA等2种不同生长素进行试验，研究结果表明，低浓度生长素生根效果良好，其中IBA能够促进生根，但生根效果不如NAA明显，诱导生根最适基础培养基为1/2MS，最佳激素NAA浓度为0.2 mg/L，其诱导生根率为92.86%。endprint

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