转基因作物中常见Bt基因PCR检测方法的建立

邵改革+闫伟+夏蔚+李葱葱+龙丽坤+李飞武

摘要：建立基于常见外源基因的转基因成分检测方法是开展转基因生物监测与检测活动的技术支撑，Bt基因作为目前商业化应用最广泛的一类外源基因，已成为转基因产品筛选检测的重要靶标。依据转基因作物中常见的6种Bt基因（cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A）的核苷酸序列设计特异性PCR引物，并经过特异性、灵敏度等一系列测试，建立上述6种Bt基因的定性PCR检测方法。结果显示，应用这些方法均可从含有相应Bt基因的样品中正确检测出预期转基因成分，方法的灵敏度可达0.10%。上述方法具有特异性强、灵敏度高等特点，适用于转基因作物中常见Bt基因的筛选检测。

关键词：转基因作物；Bt基因；定性PCR方法

中图分类号： Q785文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）12-0031-04

与全球转基因作物商业化蓬勃发展相对应的是人们对于转基因技术产品的安全性越来越重视。加强转基因产品监管，已成为世界各国管理转基因技术的一贯做法，开发行之有效的检测技术则成了转基因监管技术支撑机构的一项重要工作[1]。PCR技术兼具特异性强、灵敏度高、结果稳定可靠等优点，在转基因产品检测方法研究中被广泛应用，根据检测靶标功能的不同，又分为筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测、转化体特异性PCR检测4类，其中基因特异性PCR检测方法以转基因作物中的外源目的基因为检测靶标，是一类常见的转基因产品成分检测方法[2]。

在已商业化应用的转基因作物中，抗虫性是仅次于抗除草剂的第二大性状，2015年抗虫转基因作物种植面积达到 8 370万hm2（包括单一抗虫性状和含有抗虫的复合性状），占全球转基因作物总面积的46.6%[3]。此外，从我国转基因作物研发进展来看，抗虫性是第一大目标性状，除了大规模商业化应用的抗虫棉花外，也有多种抗虫转基因玉米、水稻、大豆新品系进入安全评价阶段[4-6]。其中，Bt基因是国内外应用最主要的抗虫外源基因，包括cry1A、cry2Ab、cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等。以Bt基因作为检测靶标的转基因检测方法已有诸多报道，Dinon等开发了转基因玉米MON89034中cry1A.105、cry2Ab2基因的实时荧光PCR方法[7]；李飞武等报道了转基因作物中cry1Ab、cry2Ab、cry3A等常见Bt基因的单一和多重PCR检测方法[8]；吴孝槐等建立了转基因大米中Bt基因的实时荧光PCR方法[9]；Liang等建立了MIR162玉米及COT102棉花中vip3A基因的实时荧光PCR方法[10]；有些Bt基因的PCR检测方法已成为国家标准或行业标准[11-12]，但未见cry1F、cry1C、cry1Ie等Bt基因检测方法的报道。

本研究以抗虫转基因作物中常见的cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6种Bt基因为对象，建立每种基因的定性PCR检测方法，为转基因生物安全监管提供有效的技术手段。

1材料与方法

1.1材料与试剂

转Bt基因玉米TC1507、IE034、59122、MIR162、MON89034、MON810、Bt11、Bt176、Bt38、SK12-5、MON863、MON88017、MIR604，转Bt基因大豆MON87701，转Bt基因棉花MON531、MON15985，转Bt基因水稻T1c-19、G6H1、KF6、KMD、T2a-1、TT51-1，及非转基因玉米、水稻、大豆、棉花均为笔者所在实验室保存样品。将TC1507、IE034、59122、MIR162、T1c-19等量混合后作为阳性对照样品，将非转基因玉米、水稻、大豆、棉花等量混合后作为阴性对照样品。

植物基因组DNA提取试剂盒：北京天根生物技术有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR反应试剂：大连宝生物工程有限公司。

1.2仪器与设备

C1000型PCR仪（美国Bio-Rad公司）；GelDoc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；ND1000紫外/可见光分光光度计（美国Thermo Fisher公司）。

1.3试验方法

1.3.1基因组DNA提取按照植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明，提取所有样品的基因组DNA，并使用ND1000分光光度计测定DNA浓度和纯度，用1×TE缓冲液稀释至25 μg/mL，置于4 ℃备用。

1.3.2Bt基因核苷酸序列分析及引物设计根据cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6种不同Bt基因的核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0（加拿大Premier公司）设计每种基因的特异性PCR检测引物。引物信息详见表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和纯化，用纯水配制成10 μmol/L溶液备用。

1.3.3PCR扩增在200 μL PCR管中加入2.5 μL 10×PCR buffer[10 mmol/L Tris-HCl（pH值为8.3）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2]，2 μL dNTPs混合溶液（每种dNTP的浓度为2.5 mmol/L），1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物（10 μmol/L），0.2 μL HS-Taq DNA聚合酶（5 U/μL），100 ng DNA模板，用ddH2O補齐至25 μL反应体系。PCR扩增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR扩增结束后，取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。endprint

2结果与分析

2.1转Bt基因作物及其外源基因检测引物筛选

商业化转基因作物数据库（ISAAA GM Approval Database）、美国农业部动植物卫生检验局网站（USDA APHIS）及国内外专利库等渠道发布的数据显示，Bt基因是当前全球抗虫转基因作物中应用最为广泛的一类外源基因，包含cry1F、cry1C、cry1Ie等在内的10余种基因。本研究收集了我国已批准的国外抗虫转基因作物及国内自主研发的重要抗虫转基因作物转化体共22种，包括转基因玉米、大豆、棉花、水稻，各个转化体的Bt基因种类详见表2。针对cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6种Bt基因的序列，分别设计了一系列PCR检测引物，进行适用性测试，最终确定了每种Bt基因的PCR检测引物（表1）。表2轉Bt基因作物信息

2.26种Bt基因的PCR检测方法特异性测试

以22种转Bt基因作物和1种非转基因作物混合物（含有非转基因玉米、大豆、水稻、棉花）作为试验材料，分别对6种Bt基因的PCR检测方法进行特异性测试，结果如图1所示。应用cry1F基因检测方法仅能从阳性对照及TC1507玉米样品中获得与预期大小一致的扩增产物（泳道27～28），同样应用其他5种基因检测方法也仅能从含有相应基因的样品中获得预期扩增产物，而在其他转基因试验材料、非转基因作物阴性样品、空白对照中均未出现扩增产物，说明这6种Bt基因检测方法均表现出对靶标基因的严格特异性。

2.36种Bt基因的PCR检测方法灵敏度测试

分别将TC1507玉米、T1c-19水稻、IE034玉米、59122玉米、MIR162玉米与非转基因作物样品按质量比进行混合，制备成相应转化体的质量分数分别为10.00%、5.00%、100%、0.50%、0.10%、0.05%、0.01%的梯度样品，提取DNA进行对应Bt基因检测方法的灵敏度测试，结果如图2所示。应用cry1F、cry1C、cry1Ie、cry34Ab基因的PCR检测方法均可从转基因含量为0.05%的样品中扩增出与预期大小一致的特异性产物，而应用cry35Ab、vip3A基因的PCR检测方法可从0.10%转基因样品中获得预期扩增，表明针对6种Bt基因检测方法的检出限均可达到0.10%，能够进行相应转基因产品的高灵敏检测。

3结论与讨论

转基因作物及其产品种类的不断增多给转基因检测工作带来了一定的挑战，选择代表性高、覆盖面广的检测靶标，并建立精准高通量的检测方法，成为转基因检测技术研究的重要方向[13]。Bt基因作为一类应用广泛的外源基因，非常适合作为筛选检测的靶标，cry1Ab、cry2Ab、cry3A等基因的检测方法也已经被开发出来[14-16]，而针对cry1F、cry1C、cry1Ie等Bt基因的检测方法尚未见报道。

本研究针对抗虫转基因作物中cry1F、cry1C、cry1Ie、

cry34Ab、cry35Ab、vip3A等6种常见Bt基因，通过引物设计与筛选、特异性测试、灵敏度测试等步骤， 建立了能准确检测上述Bt基因的PCR检测方法，上述方法的检测灵敏度均可达到0.10%，为转基因作物的筛选检测提供了方法支持。此外，将这些方法与预制PCR、多重PCR等技术结合，还可建立更加快速、便捷、高效的转基因检测方法，更好地应用于转基因产品成分检测工作。

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