小麦茎基腐病原菌的分离与鉴定

姚 琴，胡广斌＃，邢玉平，朱兆香，郭树林，陈孝仁

（1.江苏省农垦农业发展股份有限公司弶港分公司，江苏东台224200；2.扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州225009)

小麦茎基腐病原菌的分离与鉴定

姚 琴1，胡广斌1＃，邢玉平1，朱兆香1，郭树林1，陈孝仁2⋆

（1.江苏省农垦农业发展股份有限公司弶港分公司，江苏东台224200；2.扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州225009)

近年来，江苏沿海地区小麦普遍出现基部叶鞘腐烂、叶枯等症状，造成一定的产量损失。为明确病原菌，对病株进行组织分离得到1株真菌。根据形态学特征，初步鉴定为微结节霉属真菌（Microdochiumnivale）。利用PCR技术对病原菌的核糖体间隔转录区域(ITS)序列进行扩增，测序比对发现与M.nivale的同源相似性为99%。经致病性测定，确定M.nivale为引起小麦基部叶鞘腐烂、叶枯等症状的病原菌，结合先前报道称之为雪腐叶枯病。

小麦；鞘腐；雪腐叶枯病；ITS；致病性

姚琴,胡广斌,邢玉平,朱兆香,郭树林,陈孝仁.小麦茎基腐病原菌的分离与鉴定[J/OL].大麦与谷类科学,2017,34(4):40-44 [2017-07-22].http://kns.cnki.net/kcms/detail/32.1769.S.20170722.1827.001.html.

近年来，由于大面积推广秸秆还田，一些腐生性的病原菌在田间不断地积累，导致后茬作物病害发生较为严重。小麦茎基腐病在江苏、河南等地相继报道，发生面积不断扩大，给小麦的生产带来一定威胁[1-4]。小麦茎基腐病是几种病害的统称，且各地报道的病原物存在一定的差异[1-4]。李伟等认为根腐离蠕孢是小麦茎基腐病的主要病原菌[2]；张向向等认为Fusarium asiaticum和Fusarium graminearum为小麦茎基腐病的主要病原物[3]。病原物的不同导致防治措施上也存在一定的差异。此外，小麦全蚀病、小麦纹枯病等病害早期症状与小麦茎基腐病非常类似，难以区分，易误判而耽误最佳防治时期[5]。本研究对江苏弶港农场小麦茎基部叶鞘腐烂等症状的病原菌进行分离，首次利用形态学结合分子生物学方法，将核糖体 DNA内转录间隔区（internal transcribed space，ITS）作为一种遗传标记，对病原菌的种进行鉴定，为制定小麦茎基腐病有效的防治措施提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 小麦茎基腐病原菌分离和纯化

发病小麦取自于江苏弶港农场小麦田。于小麦基部叶鞘病健交界处切取若干5 mm2的组织块，用漂白粉消毒后，按常规的组织分离法进行分离培养。采用单孢分离法纯化菌株。

1.2 小麦茎基腐病原菌鉴定

菌株接种到PDA平板上，置25℃恒温培养箱内培养，记录生长速率，观察形态特征。在灭菌的培养皿内加入5 mL无菌水，挑入少许气生菌丝于无菌水中，25℃下培养3～5 d后，观察是否有厚垣孢子产生[6]。菌株接种至液体PDA培养基，25℃、150 r/min培养3d后收集菌丝，利用吸水纸挤干水分，采用CTAB法提取DNA。采用引物ITS4(5＇-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3＇)和ITS5(5＇-GGAAGTAAAAGTCGT AACA AGG-3＇)扩增真菌核糖体DNA的ITS1-5. 8S rRNA-ITS2片段。PCR扩增体系 (20 μL)：10× PCRBuffer 2 μL，模板DNA 100～300 ng，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.2 μL，dNTPs (2.5 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶 (5 U/μL)0.2 μL，ddH2O补齐到20 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃复性30s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸5 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，通过胶回收试剂盒(AXYGENAxyPrep DNA Gel Extraction Kit，杭州爱思进公司)纯化回收后连接至pMD18-T载体，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，送上海生物工程有限公司测序。测序结果提交至NCBI进行比对分析。

1.3 病原菌致病力测定

致病力测定采用培养皿幼苗直接接种培养法[7]。小麦种子在培养皿中利用滤纸保湿培养，出芽7 d后，将孢子悬浮液(105个/mL)直接接种于培养皿中，保持菌液浸没种子24 h，接种后保湿48 h，以后只浇清水，于光照培养箱中培养，观察发展情况。

2 结果与分析

2.1 小麦茎基腐病症的田间调查

2016年对江苏省弶港农场小麦基部病害进行调查。小麦茎基腐病症在该地区田间发生普遍，2月份调查发现田间病株率在30%左右，部分田块高达80%。该地区田间典型症状为初期基部叶鞘为黄褐色，随着病害的发展叶鞘颜色逐渐加深至深褐色，致使叶鞘及与之相连的整个叶片坏死(图1A)。小麦拔节后，病害往上部叶鞘发展，病株基部第1至2节间的叶鞘变褐、腐烂，随之导致相连叶片枯死(图1B)。小麦孕穗期，在病株基部坏死的叶鞘上能够观察到黑色的子囊壳(图1B)，在群体密度大、湿度高的情况下，小麦基部叶鞘及茎秆上出现粉红色的霉层(图1B、图1C)。感病植株生长衰弱，导致小麦上部功能叶早衰，影响千粒质量，严重植株基部坏死导致枯白穗。感病小麦根系不发达，基部茎秆易折，灌浆后易发生倒伏现象(图1D)。

图1 小麦茎基腐病田间症状

2.2 小麦茎基腐病原菌分离菌株的形态鉴定

利用组织分离法，从病株上分离到1个菌株。菌株在PDA培养基上能够产生白色的絮状气生菌丝，培养基背面为淡橘红色，经测量其在25℃、PDA培养基上生长速率为1.07 cm/d(图2A、图2B)。培养25 d左右能够在平板上产生肉眼可见的橘红色粘分生孢子团(25℃)。研究表明，低温有助于该病原菌分生孢子的产生，故待菌丝长满平板后，将培养皿放入4℃环境下，能够使得分生孢子产生时间提前5 d左右。分生孢子呈镰刀状，平均大小为20.1 μm×4.31 μm，1～3个隔膜，其中以一个隔膜居多，达90%以上(图2C)。对田间采集的子囊壳进行镜检，能够发现子囊及子囊孢子(图2D、图2E)。子囊壳近椭圆形，平均大小188.47μm×162.11μm，内生子囊孢子呈柱状（58.03 μm×6.57 μm），子囊孢子大小13.82 μm×4.63 μm。此外，菌丝在无菌水中培养5d后未能观察到厚垣孢子。综合上述特征，初步鉴定该病原菌为微结节霉属真菌（Microdochiumnivale）。

图2 分离菌珠的形态特征

2.3 小麦茎基腐病原菌分离菌株的分子鉴定

为进一步确认形态学鉴定的结果，利用真菌通用引物ITS4和ITS5组合扩增病原菌核糖体DNA的ITS1-5.8S rRNA-ITS2片段。PCR产物电泳检测条带特异，测序分析片段全长为581 bp。将序列在NCBI数据库进行同源性分析比对，结果表明菌株与M.nivale同源相似性为99%。结合形态学和分子生物学鉴定结果，确定该菌为M.nivale。

图3 ITS序列同源比对结果

2.4 小麦茎基腐病原菌分离菌株的致病性测定

致病性测定表明，M.nivale室内接种引起的症状与田间基本一致。在接种早期(接种后10 d左右)能够导致小麦基部叶鞘变褐(图4B)，随着接种时间延长，逐渐向叶片发展，导致叶片枯黄并且死亡(图4C)，接种植株发病率高达100%。对照在观察的时间段内均未出现上述症状。与对照相比，萌动种子受侵染颜色加深、腐烂，种子根也呈黑褐色(图4B、图4C)。进一步通过科赫氏法则确定，引起该地区小麦基部叶鞘腐烂的病原菌为M.nivale。并结合国外相关报道[12-13]，将所致病症定为小麦雪腐叶枯病。

图4 M.nivale室内接种小麦症状

3 结论与讨论

综上所述，本研究将小麦茎基腐病病原菌鉴定为M.nivale，而M.nivale是一种世界范围内广泛分布的、具有重要经济价值的植物病源真菌。M. nivale寄主范围广泛，主要危害小麦、大麦、燕麦、黑麦、草坪草及牧草等禾本科作物[8]。M.nivale早期被称为Fusarium nivale，1980年Gams等认为其与镰刀菌存在较大的差异而将其命名为Gerlachia nivale[9]。随着分类研究的进展，Samuels等在1983年将其划分至微结节霉属(Microdochium)中并命名为M.nivale，一直沿用至今[10]。M.nivale在小麦苗期能够引起2种重要的病害，即红色雪腐病和雪腐叶枯病。红色雪腐病主要发生在北欧、加拿大以及我国新疆北部和黑龙江冬麦区等冬季气温低、积雪时间长且积雪厚的地区[5，8，11]，作物被侵染后死亡率很高，常常需要重新补种；在温度较高地区，M.nivale导致小麦基部叶鞘腐烂、叶枯等症状，称为雪腐叶枯病[12-13]。

商鸿生等报道雪腐叶枯病在小麦叶片典型症状为椭圆形的大斑，直径2～3 cm[5,14-16]。本次调查未能发现该类叶斑，可能与小麦品种及病原菌差异所致。李伟等先前在江苏地区分离到M.nivale，致病性测定其致病力较弱[2]。本研究中，田间调查发现由M.nivale引起鞘腐等症状发病率普遍在30%左右，严重者后期能够蔓延至中部叶鞘，导致小麦早衰，千粒质量及产量严重下降；室内致病性测定发现其致病率高达100%，为该地区重要的致病菌。Snider等人研究发现M.nivale最适生长温度在10℃左右，零下5℃仍然活跃[17]。本研究室内培养发现，M. nivale在低温环境下更易产生分生孢子，利于病害的发展。由此，田间病害调查与防治应立足早春，以防止病害进一步扩展。M.nivale同时也是小麦赤霉病的病原菌之一，在小麦抽穗扬花期间能够侵染穗部导致枯白穗；小麦收获后，遇潮湿气候能够在麦粒上腐生产生毒素，降低小麦品质[13,18-19]。下一步研究将关注该病害的防治，筛选出高效防治药剂，以期为江苏省乃至全国小麦雪腐叶枯病的防治工作提供技术指导。

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[3]张向向,孙海燕,李 伟,等.我国冬小麦主产省小麦茎基腐镰孢菌的组成及其致病力[J].麦类作物学报,2014,34(2): 272-278.

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Isolation and Identification of the Pathogenic Fungus Causing Root and Crown Rot of Wheat

YAO Qin1,HU Guang-bin1＃,XING Yu-ping1,ZHU Zhao-xiang1,GUO Shu-lin1,CHEN Xiao-ren2
(1.JianggangBranch ofJiangsu ProvincialAgriculturalReclamation and DevelopmentCo.,Ltd.,Dongtai224200,China; 2.College ofHorticulture and PlantProtection,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)

In recent years,wheat grown in Jiangsu coastal areas developed disease symptoms manifested by decaying leaf sheaths and withered leaves,resulting in a certain degree of yield loss.A fungal isolate was obtained from diseased wheat tissues.Based on its morphological features,the fungal isolate was initially identified asMicrodochiumnivale.Its internal transcribed space (ITS)was amplified through PCR and subsequently sequenced.The comparison between its ITS sequence and that ofM.nivalerevealed that they have 99%homology.Furthermore,the isolatedM.nivaledemonstrated the ability to cause wheat sheath rot and leaf blight in the assay of pathogenicity determination.Taken together,the above results confirm that the pathogenic fungus causing root and crown rot of wheat isM.nivale.Based on the results in this study as well as previous reports,the disease caused by this pathogen is found to be snow mold disease.

Wheat;Leaf sheath rot;Gerlachia leaf blight;ITS;Pathogenicity determination

S432.1

A

1673-6486-20170323

2017-02-18

姚 琴（1989—），女，硕士研究生，主要从事病虫测报及防治工作。E-mail:1032352530@qq.com。

＃共同第一作者：胡广斌（1969—），男，高级农艺师，主要从事农业术管理与推广。E-mail:531253569@qq.com。

⋆通讯作者：陈孝仁（1978—），男，博士，副教授，主要从事真菌病害研究。E-mail:31322926@qq.com。