美洲大蠊提取物对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞的影响

吴道勋，邵维莉，常旭，欧红丽，张瀚丹，陈俊雅，3*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.大理大学基础医学院，云南大理671000；3.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理671000）

美洲大蠊提取物对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞的影响

吴道勋1，邵维莉1，常旭2，欧红丽2，张瀚丹1，陈俊雅1，3*

（1.大理大学药学与化学学院，云南大理671000；2.大理大学基础医学院，云南大理671000；3.云南省昆虫医药研发重点实验室，云南大理671000）

目的：研究美洲大蠊提取物对BALB∕c荷瘤小鼠脾淋巴细胞的影响。方法：灌胃给予BALB∕c荷瘤小鼠低、中、高剂量的（50、100、200 mg∕kg）美洲大蠊提取物（EPA），阳性组给予环磷酰胺（CTX，50 mg∕kg），给药10 d后处死小鼠，测定小鼠脾脏中T淋巴细胞和外周血中LY、MO、GR细胞的含量，并计算抑瘤率。结果：EPA能增加脾脏中CD8+的含量，与模型组相比，明显提高肿瘤生长抑制率（P＜0.05）。结论：美洲大蠊能抑制H22肝癌小鼠的肿瘤生长，其机制可能与脾脏中CD8+含量增加有关。

美洲大蠊；H22荷瘤小鼠；脾脏；淋巴细胞

美洲大蠊（Periplaneta americana）为昆虫纲，蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，因其具有良好的活血化瘀功效，使得美洲大蠊成为国内主要饲养的药用蜚蠊。传统中医学最早就有其药用作用的记载，我国第一本经典药学专著《神农本草经》有关于蜚蠊的记载为“味寒咸，主血淤，瘕坚，寒热，破积聚，喉咽痹，内寒，无子”，现代药理学关于蜚蠊的药用价值有了更深层次的发现，如组织修复，抗炎，抗心肌缺血，抗心律失常，抗肝脏损伤，抗肿瘤和免疫增强等作用〔1-7〕。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料BALB∕c小鼠，体重（20±2）g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号为SCXK（湘）2013-0004；美洲大蠊提取物（EPA，由大理大学刘光明教授提供）；环磷酰胺（CTX，山西普德药业股份有限公司，批号：04131206）；XFA6000动物血细胞分析仪用稀释液（南京普朗医疗设备有限公司，批号：PD1501）；HB探针清洗液（南京普朗医疗设备有限公司，批号：PB9407）；ANI-3D溶血剂（南京普朗医疗设备有限公司，批号：PF2402）；HB含酶清洗液（南京普朗医疗设备有限公司，批号：PB7501）；FITC Hamster Anti-Mouse CD3e，（美国BD公司，批号：553062）；PE Rat Anti-Mouse CD4，（美国BD公司，批号：553049）；Per-CP Rat Anti-Mouse CD8a，（美国BD公司，批号：553036）。

1.2 实验仪器台式冷冻离心机（ScanSpeed，型号：1580MGR）；流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司）；全自动动物血细胞分析仪（南京普朗医疗设备有限公司，型号：XFA6000）。

2 实验方法

2.1 荷瘤小鼠造模取第2代腹水保种传代的H22小鼠肝癌细胞，在光学显微镜下用台盼蓝拒染法计数活细胞的数量，保证细胞活率＞95%进行动物实验。无菌条件下将细胞密度调整为2.0×106个∕mL，每只小鼠按0.2 mL接种于右腋皮下。

2.2 分组给药取接种第2天后的BALB∕c小鼠30只，随机分为5组，每组6只，实验设置模型组（注射生理盐水），阳性组（注射CTX，50 mg∕kg），EPA给药组（低、中、高剂量分别为50、100、200mg∕kg），未接种瘤细胞小鼠为正常组。正常组和模型组每天给生理盐水，阳性组按0.1 mL∕10 g小鼠体重腹腔注射环磷酰胺，连续给药3 d，治疗组按0.2 mL∕10 g小鼠体重给EPA，除阳性组外其余各组连续给药10 d。

2.3 检测指标

2.3.1脾细胞中T细胞亚群的测定给药12 h后，无菌操作取脾脏，置于细胞筛网上，用PBS（含3%血清）研磨成单细胞悬液，台盼蓝计数，调整细胞浓度为107个∕mL，取细胞悬液100 μL加入流式管中，做FITC-CD3-Ab、PE-CD4-Ab、Per-Cp-CD8-Ab抗体染色，用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+细胞百分比。

2.3.2外周全血中淋巴细胞（LY）、单核细胞（MO）、中性粒细胞（GR）测定末次给药后禁食12 h，眼内眦静脉取血，取20 μL加入稀释液，用动物血细胞分析仪测淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞的数量。

2.3.3抑瘤率的测定颈椎脱臼处死小鼠取肿瘤并称量，分别按下面公式计算肿瘤生长抑制率：肿瘤生长抑制率=［（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）∕对照组平均瘤重］×100%。

2.4 数据分析采用SPSS 21.0分析软件进行统计学分析，数据用均数±标准差表示，各组均数的比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 EPA对外周血T细胞亚群的影响与正常组相比，EPA低、中、高剂量组对CD3+细胞、CD8+细胞、CD4+∕CD8+有下调的作用（P＜0.05），对CD4+细胞无明显作用；与阳性组相比，EPA各组CD3+细胞均明显的减少（P＜0.05或P＜0.01），EPA中、高剂量上调CD8+细胞、CD4+∕CD8+（P＜0.05），差异有统计学意义。见表1和图1～4。

表1 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血T细胞亚群的影响

表1 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血T细胞亚群的影响

注：与正常组相比#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比*P＜0.05；与阳性组相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

图1 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+细胞的影响

图2 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血中CD4+∕CD8+细胞的影响

图3 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血中CD3+细胞的影响

图4 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血中CD4+和CD8+细胞的影响

3.2 EPA对外周血LY、MO、GR的影响阳性组与模型组相比LY、MO、GR的含量均明显减少（P＜0.01）；EPA低、中、高剂量组与正常组相比，均能明显增加MO、GR的含量（P＜0.05），与阳性组相比，EPA各组均对LY、MO、GR的细胞数有增加作用，除EPA低剂量组对LY的作用外，其余各组均表现出显著的差异（P＜0.05或P＜0.01），差异有统计学意义。见表2和图5。

表2 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血LY、MO、GR的影响

表2 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血LY、MO、GR的影响

注：与正常组相比#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性组相比△P＜0.05，△△P＜0.01。

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图5 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠外周血中LY、MO、GR的影响

3.3 EPA对H22肝癌肿瘤小鼠肿瘤抑制率的影响阳性组与模型组相比，瘤重显著性下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；EPA中、高剂量组与模型组相比，瘤重明显降低（P＜0.05），与阳性组相比，EPA低、中剂量对瘤重差异有统计学意义（P＜0.05）；见表3和图6。

表3 EPA对H22肝癌肿瘤抑制率

表3 EPA对H22肝癌肿瘤抑制率

注：与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01；与阳性组相比△P＜0.05。

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图6 EPA对H22肝癌肿瘤抑瘤率

4 分析和讨论

肿瘤的产生是一个复杂的过程，其产生的原因和治疗手段都还未完全了解，但随着对肿瘤与机体免疫的关系的深入研究，特别是对免疫微环境〔8〕、免疫监视和免疫逃逸〔9〕等相关概念的进一步认识，免疫治疗逐渐成为治疗肿瘤的一种方式。细胞免疫是机体免疫的一种重要方式，免疫系统对病毒和化学原因引起的肿瘤免疫作用中，T淋巴细胞占有重要的作用〔10-11〕，T淋巴细胞来源于骨髓中的淋巴样前祖细胞，在胸腺中发育成熟，其可分为若干个亚群，各亚群之间相互调节，共同发挥其免疫学功能，其中CD3分子的功能是转导T细胞抗原受体（TCR）的识别抗原所产生的活化信号作用，CD4和CD8分子只有成熟的T细胞才能表达，其主要功能辅助TCR识别抗原和参与T细胞活化信号的转导，成熟的T细胞按其CD分子表型不同可分为CD3+、CD4+、CD8+细胞，其分化后，CD4+主要为效应Th细胞，而CD8+主要为细胞毒Tc细胞〔12〕，可特异性杀伤靶细胞。

本实验用EPA作用H22肝癌移植瘤的BALB∕c小鼠，结果显示，EPA相对于模型组能提高脾脏细胞中的CD8+的含量，CD4+∕CD8+的比值相对正常组也相对提高，与阳性组相比，EPA中、高剂量对CD8+细胞、CD4+∕CD8+有增加的作用，表明EPA能提高细胞免疫功能。通过对血中的LY、MO、GR的测量结果显示，EPA对荷瘤小鼠的外周中的LY、MO、GR相对模型组没有明显的改变作用，但与阳性组相比，EPA各组均对LY、MO、GR的细胞数有增加作用，但在抑制肿瘤生长方面，EPA组的中剂量和高剂量组与模型组相比，能明显的减轻肿瘤的重量，与阳性组相比，EPA低、中剂量对瘤重差异有统计学意义；EPA低、中、高剂量组抑瘤率分别为24.00%，38.29%，49.39%，说明在抗肿瘤方面有一定的作用。

以上结果表明，EPA可通过调节脾淋巴细胞的含量，增强机体免疫功能，进而发挥一定的抗肿瘤活性，为进一步研究和开发美洲大蠊的药用价值提供了实验基础。

〔1〕牛春丽，曾菁，夏盟恺，等.肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎的影响〔J〕.大理学院学报，2015，14（4）:12-16.

〔2〕陈俊雅，李洪文，吴道勋，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3抗炎作用及机制研究〔J〕.大理学院学报，2015，14（2）:8-11.

〔3〕陆丽，张旭强，甘平，等.美洲大蠊提取物对ISO致大鼠心肌缺血的保护作用〔J〕.大理学院学报，2014，13（8）:7-10.

〔4〕彭丽，陆丽，张旭强，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3对大鼠心律失常的保护作用〔J〕.大理学院学报，2011，10（12）:6-9.

〔5〕张旭强，何旭，陈俊雅，等.美洲大蠊提取物CⅡ-3对大鼠急性酒精性肝损伤的保护作用〔J〕.大理学院学报，2011，10（12）:1-5.

〔6〕张小雪，李春艳，徐静，等.美洲大蠊提取物对肝星状细胞增殖能力的影响〔J〕.大理学院学报，2012，11（6）:16-19.

〔7〕李娇，张冰清，刘光明，等.美洲大蠊脱脂膏对小鼠免疫功能的影响〔J〕.大理学院学报，2015，14（10）：1-5.

〔8〕廖云梅，阮志华.肿瘤微环境在肿瘤免疫治疗中的研究进展〔J〕.免疫学杂志，2014，30（12）：1104-1107.

〔9〕王盛典，贾明明.肿瘤免疫微环境在肿瘤常规治疗效应中的作用〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，2012，19（3）：229-238.

〔10〕XIA Y H，WANG Z M，CHEN R X，et al.T-cell apoptosis induced by intratumoral activated hepatic stellate cells is associated with lung metastasis in hepatocellular carcino⁃ma〔J〕.Oncol Rep，2013，30（3）：1175-1184.

〔11〕WANG W J，TAO Z，GU W，et al.Variation of blood T lym⁃phocyte subgroups in patients with non-small cell lung cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（8）：4671-4673.

〔12〕张京雨，张晓明.CIK细胞过继性免疫治疗对结直肠癌化疗患者免疫指标的影响〔J〕.肿瘤基础与临床，2009，22（1）：51-53.

The Effects of Periplaneta americana Extract on Spleen Lymphocytes of H22Tumor-bearing Mice

Wu Daoxun1,Shao Weili1,Chang Xu2,Ou Hongli3,Zhang Handan1,Chen Junya1,3*
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali, Yunnan 671000,China;3.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To study the effects ofPeriplanet americanaextract on spleen lymphocytes of H22Tumor-bearing mice.Methods：BALB∕c mice were administered with low dose,middle dose and high dose ofPeriplaneta americanaextract（50,100,200 mg∕kg）by gavage.The positive group was injected with 50 mg∕kg cyclophosphamide.After 10-day feeding and injection respectively the content of T lymphocytes in the spleen,lymphocyte cells,Monocyte cells and granulocyte cells in peripheral blood were measured,and the anti-tumor rate was calculated.Results：ThePeriplaneta americanaextract could obviously increase the content of CD8+and the tumor growth inhibition rate（P＜0.05）compared with the normal group.Conclusion：Periplaneta americanaextract can inhibit the growth of H22liver tumor in mice and its mechanism may be related to the increase of the content of CD8+in the spleen.

Periplaneta americana；tumor H22-bearing mice；spleen；lymphocytes

R285

A

2096-2266（2017）08-0001-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.001

（责任编辑 李杨）

国家自然科学基金资助项目（81560600）；大理大学青年教师科研基金资助项目（KYQN201337；KYQN201309）

2016-09-30

2017-04-19

吴道勋，硕士研究生，主要从事天然药物药理学研究.

*通信作者：陈俊雅，实验师.