决明子多糖酵母微囊制备条件优化及对HepG2细胞抑制作用研究

洪自兵，孙洁琼，刘 梅，王 可，李 森，姚向阳

（蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030）

决明子多糖酵母微囊制备条件优化及对HepG2细胞抑制作用研究

洪自兵，孙洁琼，刘 梅，王 可，李 森，姚向阳*

（蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030）

以包埋时间、加水量、芯材比、包埋温度为正交实验的因素考察对决明子多糖微囊化的影响。结果显示包埋时间6小时、加水量 4mL、芯材比为3∶1（g/g）和包埋温度 40℃，决明子多糖微囊的包埋率为 49.3%。HepG2细胞在决明子多糖酵母微囊（100mg/mL）中的MTT生存率是46.9%，LDH活性是176.9%，且HepG2细胞会皱缩、分离。

决明子多糖；酵母微囊；正交实验；HepG2细胞；抑制作用

0 引言

决明子味苦、甘、咸，具降压、降脂、保肝、抗菌的功效[1]。决明子多糖是决明子重要的药理活性物质。决明子多糖具有降血脂[2-3]，增强动物的免疫[4-5]和抗氧化作用[6]。

酵母微囊为球形或椭球形，粒径一般在几微米到二十微米，可分散到不同的体系中。决明子多糖分子量大，不易吸收，将其制成微囊避免在发挥药效前被降解，延长了药效，提高了生物利用率[7-8]。本研究首先通过单因素实验，确定时间、加水量、芯材比和温度与包埋率的关系，设计四因素三水平正交实验优化决明子多糖酵母微囊制备工艺。检测决明子多糖酵母微囊对HepG2细胞MTT和LDH活性及形态的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

决明子 (亳州市祥云养生堂花茶有限公司)，酵母粉（安琪），MTT（Sigma），LDH 试剂盒（南京建成），木瓜蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司），其他试剂为分析纯。

恒温摇床振荡培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司），真空干燥机（Eppendorf），超声波提取仪，酶标仪（Thermo Fisher Scientific），倒置显微镜（AE2000，配佳能数码相机），鼓风干燥箱，粉碎机，电子天平，旋转蒸发仪，高速冷冻离心机。

1.2 方法

1.2.1 决明子多糖提取工艺流程

取决明子药材于烘箱中烘干（50℃，24 h），粉碎，过80目筛。取20 g药材粉末以石油醚脱脂6 h，纱布过滤，挥干。加入蒸馏水（1∶25），于 80℃下浸泡 30min，再于 200 W 的条件下超声辅助提取30min。离心，取上清液，加入木瓜蛋白酶（取药材量1/50），60℃下酶解2 h，离心，取上清液，按5∶1的比例加入Sevage试剂，多次萃取离心除去蛋白。取清液按1∶1比例加入 15%双氧水溶液脱色处理6 h，浓缩，再用无水乙醇醇沉后（水提液与乙醇按1∶3比例加入）置于4℃冰箱中过夜，在5000 r/min下离心10min得沉淀；用丙酮20mL及乙醚重复洗涤2次，自然晾干，再放入烘箱（50℃，24 h），烘干，碾碎，得多糖成品[10]。最后得到多糖成品1.086 6 g，决明子多糖提取率为5.43%。

1.2.2 决明子多糖含量测定

取无水葡萄糖5mg，配置成0.1mg/mL的葡糖糖溶液[9]。再分别吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL上述葡萄糖溶液置10mL刻度试管中，分别加蒸馏水1mL和1mL 5%苯酚溶液，混匀后快速加入5mL浓硫酸，使反应液充分混合，然后将试管置于40℃恒温振荡培养箱中反应30min，取出冷却，加水至10mL，于490 nm测吸光度[11]。根据吸光度值(y)和标准葡糖糖溶液浓度(x)得到回归方程：y=1.091 4x-0.000 9，R2=0.997 3。取0.01 g决明子多糖，配置成50mL决明子多糖溶液，再取1mL决明子多糖溶液重复上述步骤操作，根据回归方程，计算多糖含量。

1.2.3 决明子多糖酵母微囊的制备

称取50.0 g干酵母并加入蒸馏水，在35℃下搅拌20 h。向复苏后的酵母溶液中加入5%的氢氧化钠溶液，于54℃，150 r/min，振荡24 h，离心收集的沉淀，冷冻干燥。将处理好的酵母细胞放入烧杯中，将一定量的决明子多糖粉末加入烧杯中，然后加入蒸馏水混合摇匀，封口后放入恒温培养振荡器。在恒温振荡器中处理一定时间后取出烧杯，将混合液在4200 r/min下离心15min，得沉淀，洗去未包入的多糖，真空干燥器（40℃）干燥1 h。根据文献[10]计算酵母微囊中决明子多糖包埋率，公式为：

式中：Y为决明子多糖包埋率/%；mA为加入干酵母质量/g；mB为收集决明子酵母微囊总质量/g。

1.2.4 MTT和LDH法检测细胞生存率

将细胞（105个细胞/孔）接种到96孔平板中12 h，用各种浓度的决明子多糖和决明子多糖酵母微囊处理，采用MTT测定法在570 nm处测量吸光度。用南京建成试剂盒测量培养基中的LDH水平，记录在420 nm处的吸光度，用于计算 Mutiskan Go（Thermo，INC）下的 LDH活性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 包埋时间对决明子多糖酵母微囊包埋率的影响

取0.06 g的决明子多糖和0.02 g处理后的酵母及6mL蒸馏水于烧杯中，振荡使其均匀，封盖之后放入摇床中，转速为100 r/min。不同时间下，决明子多糖酵母微囊包埋率如图1。

图1 包埋时间对决明子多糖酵母微囊包埋率的影响

由图1可知，随时间的不断增加，决明子多糖酵母微囊包埋率也在不断加大，6 h后，包埋率上升趋势平缓，所以最佳包埋时间为6 h。

2.1.2 加水量对决明子多糖酵母微囊包埋率的影响

取0.06 g的决明子多糖和0.02 g处理后的酵母及蒸馏水于烧杯中，振荡使其均匀，封盖之后放入摇床中6 h，转速为100 r/min。不同量蒸馏水下决明子多糖酵母微囊包埋率见图2。

图2 加水量对决明子多糖酵母微囊包埋率的影响

由图2可知，随加水量的不断增加，决明子多糖扩散进入酵母的量先增加后减小，当加水量为6mL时，决明子多糖的包埋率最大。

2.1.3 芯材比对决明子多糖酵母微囊包埋率的影响

取不同量的决明子多糖和0.02 g处理后的酵母及6mL蒸馏水于烧杯中，振荡使其均匀，封盖之后放入摇床中6 h，转速为100 r/min。不同的芯材比下决明子多糖的包埋率见图3。

图3 芯材比对决明子多糖酵母微囊包埋率的影响

由图3可知：随芯材比的逐渐加大，决明子多糖的浓度也不断变大，从而使决明子多糖进入酵母的速率变大即包埋率变大了；当芯材比为3∶1时，决明子多糖进入细胞内的浓度已达到饱和，包埋率不再增加。

2.1.4 温度对决明子多糖包埋率的影响

取0.06 g的决明子多糖和0.02 g处理后的酵母及6mL蒸馏水于烧杯中，振荡使其混合均匀，封盖之后放入摇床中6 h，转速为100 r/min。不同温度下决明子多糖包埋率如图4。

图4 温度对决明子多糖包埋率的影响

由图可知温度对决明子多糖酵母微囊包埋率的影响是先增加后很少，40℃时包埋率达到最高。

2.2 正交实验设计

在单因素试验基础上，采用4因素3水平的正交实验，四个因素为时间、加水量、芯材比以及温度。结果如下：

表1 因素与水平表

表2 L9(34)正交试验

表3 方差分析

本试验的最优组合为A3B1C3D2，即40℃、6 h、芯材比为3∶1，4mL蒸馏水。正交试验得到的最优包埋率为55.0%，3次验证试验，得到的平均包埋率是49.3%。极差和方差分析说明温度是包埋率的主要影响因素，实验中部分组别多糖包埋率不是很高，可能的原因为采用的包埋壁材为活性较低的干酵母。 Ciamponi报道酵母活性影响微囊化过程[11]。另一个原因可能是决明子多糖纯度不高，含杂质蛋白或多酚，文献报道可使用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）纯化多糖，提高包埋率[12]。

2.3 决明子多糖酵母微囊对HepG2细胞生存率的影响

为探讨决明子多糖酵母微囊对HepG2细胞生存率的影响，HepG2细胞用不同浓度的决明子多糖酵母微囊处理24 h，如图5a所示，决明子多糖及决明子多糖酵母都能抑制HepG2生存率（CP 50：76.8%，CP 100：64.1%，CPYM50：56.3%，CPYM100：46.9%），但决明子多糖酵母比决明子多糖的抑制效果好（CP50：76.8%，CP100：64.1%，CPYM50：56.3% ，CPYM100：46.9%)。LDH降低经常被用于评估细胞损伤程度。决明子多糖酵母比决明子多糖更能增加LDH水平（133.4%，140.1%，167.9%，176.9%）（图5b）。

图5 决明子多糖酵母微囊对HepG2细胞生存率的影响

2.4 决明子多糖酵母微囊对HepG2细胞形态的影响

显微观察显示决明子多糖和决明子多糖酵母微囊被处理24 h后，都能引起HepG2细胞皱缩、脱离（图6）。表明决明子多糖和决明子多糖酵母均可抑制HepG2细胞的生长。这些结果一致于MTT和LDH实验。很多多糖具有抗肿瘤活性[13]，但多糖易吸湿、对酸碱、金属离子不稳定，多糖的微囊化处理是克服这些缺点的重要方法。Paramera等报道酵母微囊化处理的姜黄素比环糊精或改性淀粉包合的更能保护有害的光化学反应和热降解[14]。微囊化姜黄素与游离姜黄素相比，能增强体外抗HepG2细胞活性[15]。我们的结果也显示酵母微囊化的决明子多糖比没有包被的更能抑制HepG2细胞的活性。

图6 决明子多糖酵母微囊对HepG2细胞形态的影响

3 结论

本实验结果显示，决明子多糖酵母微囊正交优化的最佳工艺为即40℃、6 h、芯材比为3∶1，4mL水，包埋率平均为49.3%。在决明子多糖酵母微囊（100mg/mL）条件下，HepG2细胞MTT生存率是46.9%，LDH活性是176.9%，HepG2会细胞皱缩、分离。本实验优化制备的决明子多糖酵母微囊对HepG2细胞有一定的抑制作用。

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Optimization of Preparation Conditions of Cassia Polysaccharide Yeast Microcapsules and its Inhibitory Effect Research on HepG2 Cells

HONG Zibinɡ，SUN Jieqionɡ，LIU Mei，WANG Ke，LI Sen，YAO Xiɑnɡyɑnɡ
（School of Food and Biology Engineering，Bengbu University，Bengbu Anhui 233030，China）

The effects of embedding time，water addition，core ratio and embedding temperature on the microencapsulation of cassia polysaccharide were investigated by orthogonal experiment.The analysis shows that:When the embedding time is 6 hours and the amount of water is 6mL，the ratio of core to material is 3∶1（g/g）.Meanwhile，when the embedding temperature is 40℃，the embedding rate of cassia polysaccharide microcapsules is 49.3%.Besides，the research shows that the survival rate of HepG2 cells for cassia polysaccharide yeast microcapsules is 46.9%.At the same time，the LDH activity is 176.9%which could cause the shrinkage and separation of the HepG2 cells.

Cassia Polysaccharide；Yeast Microcapsule；Orthogonal Experiment；HepG2 Cell；Inhibiting Effect

R283

A

1009-8666（2017）08-0015-06

［责任编辑、校对：李书华］

10.16069/j.cnki.51-1610/g4.2017.08.004

2017-06-11

大学生创新创业项目“决明子多糖胶囊制备及体外降脂分析”（201511305027）；安徽省教育厅高校自然科学重点项目“蒲公英萜醇调控STAT3通路和自噬功能诱导肿瘤细胞死亡的机制研究”（KJ2014A149）

洪自兵（1996—），男，安徽芜湖人。蚌埠学院食品与生物工程学院制药工程专业2014级本科生。

*通信作者：姚向阳（1972—），男，安徽合肥人。蚌埠学院食品与生物工程学院副教授，博士，研究方向：食品药品中活性物质分子药理、毒理研究。