白果直链/支链淀粉的分离及性能研究

张彩虹， 黄立新， 谢普军， 邓叶俊， 陈虹霞

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京210042；2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091)

白果直链/支链淀粉的分离及性能研究

ZHANG Caihong

张彩虹1,2， 黄立新1*， 谢普军1， 邓叶俊1， 陈虹霞1

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业局 林产化学工程重点开放性实验室；江苏省 生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京210042；2.中国林业科学研究院 林业新技术研究所，北京 100091)

以白果为原料，对其淀粉进行提取分离，对直/支链淀粉进行纯化，分别对其性能进行分析测定，测定结果如下： 400～800 nm范围内全波长扫描，淀粉-碘络合物最大吸收波长不同，原淀粉与碘络合后在600 nm处，直连淀粉与碘络合后在620 nm处，支链淀粉与碘络合后在560 nm处；白果原淀粉、直链淀粉、支链淀粉在真空条件下干燥后，颗粒大小均在20 μm以下，且扫描电镜(SEM)显示白果原淀粉颗粒为椭圆状，提取后的白果直链淀粉及支链淀粉均无固定形状；DSC分析后发现含水量50%的白果直链/支链淀粉乳液峰值温度(Tp)为 138.23 ℃/76.6 ℃，均为糊化温度，含水量小于5%白果直链/支链淀粉Tp为117.56 ℃/94.83 ℃，均为脱残留水分的吸热峰。由凝胶色谱结果分析得到，白果直链淀粉由两种直链淀粉组成，分子质量分别为10.31和2.32 ku；白果支链淀粉分子质量为1 189.05 ku。

白果；直链淀粉；支链淀粉；SEM；DSC

白果又名银杏(GinkgobilobaLinn.)，第四纪孑遗植物,为我国的特有树种。我国不仅是白果的故乡，而且也是栽培、利用和研究白果最早、成果最丰富的国家和地区之一。近20年来，我国各级地方政府高度重视白果产业的发展，逐年扩大种植面积，产量不断上升，近年白果年产量已超过14 000吨[1]，但银杏白果的利用率一直不高，除部分入药外[2]，仅局限在炒、烤、煮、配菜、糕点、蜜饯、罐头、饮料和酒类等食用方面的简单加工，生产的多为即用型产品，保质期较短，市场有限[3-7]。因此对银杏白果深加工研究并形成产业链成为亟待解决的问题。根据白果自身特性的研究发现，白果内淀粉为其主要成分[8]，约占总质量的60%～70%(绝干质量),几乎与玉米、小麦的淀粉含量相同，但对其开发利用至今仍然处于空白状态。本研究在提取得到白果原淀粉的基础上分离纯化，对制得的直链淀粉和支链淀粉进行分离纯化，并对其性能进行分析，为白果淀粉的开发利用提供研究数据。

1 实 验

1.1 原料、试剂及仪器

白果，江苏泰兴的大佛指。NaOH、乙醇、石油醚(30～60 ℃)、正丁醇-异戊醇、二甲亚砜、HCl、碘、碘化钾、乙酸等，均为分析纯。

AR2140电子天平；LC-20A高效液相色谱，日本岛津；TU- 6紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱；TG16-WS台式高速离心机；Wizard 2.0型真空冷冻干燥机；DZF型真空干燥箱；3400-Ⅰ型扫描电子显微镜(SEM)，日本日立公司； DSC 型扫描量热分析仪，美国Perkin-Elmer 公司。

1.2 白果原淀粉的制备

白果去壳，去内果皮，捣碎，按质量比3 ∶1(以白果质量汁)加入质量分数1%的NaOH水溶液，浸泡3 h，用纱布过滤；按上述方法，将滤渣浸泡过滤3次。将滤液合并，静置1 h，除去上层清液，再加入上清液等体积的水，搅拌均匀后，静置1 h，再除去上清液，如此重复3次。然后用布氏漏斗过滤静置在底部的淀粉，进行分离得到湿淀粉，采用冷冻干燥将湿淀粉干燥，密封，常温保存。

冷冻干燥白果淀粉用无水乙醇按1 ∶10(g ∶mL)在恒温水浴中(40 ℃)脱色、脱蛋白6 h，每小时用玻璃棒搅拌5 min;之后，再用沸点为30～60 ℃石油醚进行索氏提取脱脂，时间为6 h,将得到的沉淀物放在恒温鼓风干燥箱中(45 ℃)干燥12 h，除去残留的溶剂，最终得到脱色、脱蛋白、脱脂的白果原淀粉，备用。

1.3 白果直链淀粉与支链淀粉的分离与纯化

1.3.1 粗分离 取10 g白果原淀粉，放入500 mL烧杯中，加少量的无水乙醇和蒸馏水，使样品湿润，再加入0.2 mol/L的NaOH溶液350 mL，在沸水浴中加热搅拌20～30 min，至完全分散，冷却后离心(4 000 r/min)20 min，去除未分散的残渣(沉淀部分)。用2 mol/L的HCl溶液中和离心液，并加入 100 mL正丁醇-异戊醇(体积比3 ∶1)混合液，然后在沸水浴中加热搅拌10 min，此时溶液透明，冷却至室温，移入冰箱，2～4 ℃静止24 h，离心(6 000 r/min)20 min，沉淀物为直链淀粉粗粉，上清液为支链淀粉粗粉溶液[9]。

1.3.2 白果直链淀粉的纯化 按文献[9]操作，将直链淀粉粗粉全部转移至装有100 mL 90%的二甲亚砜热溶液中，加入200 mL热的正丁醇饱和水溶液，然后置沸水浴中搅拌直至溶液分散透明，再冷却至室温，移入冰箱内，2～4 ℃静止24 h，取出离心20 min(6 000 r/min)，将得到的沉淀物重复上述操作6次，最后用砂芯漏斗抽滤，以无水乙醇洗涤数次，室温下真空干燥，即得到白果直链淀粉，得率20.1%。

1.3.3 白果支链淀粉的纯化 支链淀粉粗粉溶液置于分液漏斗中静置，取下层溶液加40 mL正丁醇-异戊醇(体积比1 ∶1)混合液，在沸水中加热搅拌直至溶液分散透明，冷却至室温，移入冰箱于2～4 ℃静置48 h，取出离心(6 000 r/min)20 min，去除沉淀物，用上清液重复上述操作3～5次，所得上清液减压浓缩至原体积的一半，加入相当于浓缩液2倍体积的无水乙醇进行沉淀，然后离心分离，将获得的离心液中再加入其2倍体积的无水乙醇，进行沉淀，离心分离。将获得的沉淀物收集，溶于200 mL蒸馏水中，用2倍蒸馏水体积的无水乙醇沉淀，离心，沉淀物以无水乙醇洗涤数次，室温下真空干燥，即得白果支链淀粉，得率23.0%。

1.4 分析检测

1.4.1 原淀粉和直链、支链淀粉的定性 分别称取原淀粉、支链淀粉和直链淀粉各0.1 g，加入1 mol/L的NaOH溶液5 mL，置于沸水浴中待其完全溶解后冷却，用2 mol/L HCl调节溶液pH值至中性，用水定容至50 mL，得到2 g/L的溶液。分别取适量的2 g/L原淀粉和直链淀粉、支链淀粉溶液，稀释到一定体积后加入0.02 g/mL碘剂0.1 mL，加入1 mol/L乙酸1 mL，再用水定容至50 mL。观察各淀粉溶液的颜色与对照的差异，同时在400～800 nm范围内对直链淀粉、支链淀粉进行全波长扫描。

1.4.2 纯度测定 碘亲和力法是根据淀粉试样对碘的亲和力的大小来求出直链淀粉及支链淀粉的含量。直链淀粉含量越高、链长越大，结合的碘量会随之增多，并且作用形成的复合物亦越稳定，得到的碘亲和力也越大，吸光值越高。

取12支20 mL具塞试管编号1～12，加入1 g/L的直链(或支链)淀粉，1号试管0 mL、2号试管 2.0 mL，其余各试管依次增加0.1 mL，分别加入一定量的水后再加入0.02 g/mL碘剂0.025 mL，1 mol/L乙酸1 mL，定容至刻度线摇匀，以1号试管做空白对照，空白与样品均稀释两倍后在620 nm处比色并计算纯度，公式如下：

(1)

p=AI2/20%

(2)

式中：m1—结合碘质量,mg;m2—淀粉-碘复合体样品干质量，mg；p—纯度，%； 20%—每克纯直链淀粉能结合200 mg 碘。

1.4.3 颗粒形貌测定 将待测淀粉样品置于105 ℃的烘箱中干燥4 h，用导电双面胶将其固定在样品台上，喷金处理后，置于扫描电镜中观测并拍摄淀粉颗粒形貌。

1.4.4 热力学性能测定 分别称取4.00 mg的直链淀粉、支链淀粉置于标准液体皿中，用移液器吸取 4.0 μL 双蒸水于标准液体皿中与淀粉混合，然后用压样机密封，其中每个样品做3个平行，在常温条件下将制备好的样品放入差示扫描量热(DSC)仪的量热计中，以10 ℃/min 的升温速率从0 ℃升到 200 ℃ 进行糊化。再由200 ℃降到0 ℃，在0～200 ℃范围内进行二次升温，速率为20 ℃/min。

1.4.5 分子质量测定 分别将分子质量为4.32、12.60、60.60、110.00、289.00、400和800 ku的葡聚糖(Dextran)配制成2 g/L溶液，分别进样，以出峰时间(t)为横坐标，以Dextran的重均分子质量(Mw)为纵坐标做标准曲线，得标准曲线公式为Mw=5×108exp(-0.932t),R2=0.980 7。将纯化后的白果直/支链淀粉按上述步骤进样，若为多个峰则说明纯化效果较差，需进一步纯化；若为单一峰说明纯化效果较好，多糖为单一组分，并根据所得保留时间，通过标准曲线公式计算其分子质量。

液相色谱条件： Waters UltrahydrogelTMLinear(7.8 mm×300 mm)凝胶柱与Waters Ultrahydrogel Guard Column(6 mm×40 mm, 6 μm)凝胶柱联用，进样量为10 μL，以流速为0.5 mL/min、浓度为 0.1 mol/L 的硝酸钠为流动性，柱温为45 ℃。

2 结果与讨论

2.1 白果淀粉的最大吸收波长及直/支链淀粉的纯度测定

由于淀粉分子具有螺旋状的卷曲，当碘分子与淀粉相接触时，碘分子可以钻入直链淀粉螺旋空隙当中,并借助范德华力进入淀粉分子的螺旋中心，形成了淀粉-碘络合物，这种络合物在可见光的照射下,可以比较均匀地吸收除蓝光以外的其它可见光,所以在可见光的全波长扫描下会形成吸收峰[10]。由图1中白果淀粉-碘络合物的颜色对比可知，碘与白果直链淀粉络合呈蓝色，与白果支链淀粉络合呈红紫色，与白果原淀粉络合呈现浅蓝色，其全波长扫描结果如图2所示。

图1 白果淀粉碘络合物颜色对比图

从图2可以看出，与白果原淀粉相比，与碘络合后直链淀粉的最大吸光值向高值偏移，而支链淀粉样品则偏向低值，3种样品在400～800 nm范围内全波长扫描的吸附曲线变化基本一致，都在 550～650 nm 间出现了最大吸收峰，但最大吸收峰波长不同，原淀粉样品与碘络合物的最大吸收峰出现在 600 nm 处，直链淀粉与碘络合物样品最大吸收峰620 nm处，而支链淀粉与碘络合物最大吸收峰出现在560 nm处。高群玉等[11]认为最大波长偏移与淀粉的平均链长有关系，平均链长越短，最大波长向低值偏移。因此3种样品中，白果直链淀粉的平均链长最长吸收峰最大；白果支链淀粉的平均链长最短吸收峰最小；白果原淀粉随直链淀粉和支链淀粉含量的不同平均链长介于两者之间，故吸收峰处于两者之间。可见，淀粉-碘络合物的吸附曲线可以在一定程度上反映出淀粉的内部链结构。

在400～800 nm范围内对直链淀粉与碘的络合物进行波长扫描发现，620 nm处直链淀粉碘络合物出现最大吸收。故在620 nm波长下对不同含量淀粉溶液进行吸光度测定。由图3直链淀粉对碘亲和力曲线可知，对直链淀粉测定中发现在2.6 mL处，出现最大吸收峰吸光度值1.64。由碘亲和力公式计算所得直链淀粉的碘亲和力19.23%，纯度为96.2%。由图3可知，支链淀粉吸光值接近0，且吸光值随支链淀粉含量增加变化很小，直链淀粉含量较低，支链纯度可达99.90%。

图2 白果淀粉碘络合物全波长扫描

Fig.2 Wavelength scanning of clathrate ofGinkgobilobastarch and I2s

图3 直链/支链淀粉与碘亲和力曲线

Fig.3 Affinity betweenG.bilobaamylase/amylopectin and I2

2.2 白果淀粉形态分析

利用扫描电子显微镜对淀粉样品的形貌进行研究分析，考察白果淀粉在分离纯化前后淀粉颗粒的表面微观结构的变化情况，结果如图4所示。

图4 白果淀粉SEM图(×2 000)

白果原淀粉、直链淀粉和支链淀粉在真空条件下干燥后，所有颗粒均在20 μm以下。天然白果原淀粉为表面致密的实心椭圆状颗粒，而提取后的白果直链淀粉及支链淀粉与原淀粉形貌完全不同，均无固定形状，表面粗糙，颗粒松散形状随意。可见，在直链淀粉、支链淀粉的分离过程中，完全破坏了淀粉原颗粒的形态，才使得直链淀粉、支链淀粉溶解出来。

2.3 白果直链/支链淀粉的分子质量

图5 白果直链/支链淀粉的HPGPC图谱Fig.5 HPGPC of G. biloba amylase and amylopectin

为便于考察后期实验过程中淀粉酶对支链及直链淀粉的酶解性能，采用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)法对物质进行分离。HPGPC的分辨率高于常压凝胶柱，分析结果较为准确。白果直/支链淀粉图谱如图5所示。由图5曲线a可知,白果直链淀粉的HPGPC图谱中呈现两个峰，这说明纯化的白果直链淀粉是由两种不同分子质量的直链淀粉所组成，出峰时间分别为18.988和20.591 min，根据标准曲线计算得两种直链淀粉分子质量分别为10.31和2.32 ku；图5曲线b为白果支链淀粉的HPGPC图谱，呈现单一峰，纯度较高，出峰时间13.894 min, 根据标准曲线计算得分子质量为1 189.05 ku。可见，白果支链淀粉分子质量远大于直链淀粉。

2.4 白果淀粉DSC性能分析

白果淀粉的200 ℃范围内的糊化温度及热性能如图6，表1所示。峰值为首次升温结果，二次升温曲线均无波动峰出现，说明一次升温后在0～200 ℃范围，淀粉已经达到了稳定状态。表1中分别列出了不同含水量的白果直/支链淀粉的热特性。含水量为50%的白果直链淀粉乳液在129.01～152.98 ℃出现最大吸热峰，峰值温度(Tp)为138.23 ℃，含水量为50%的白果支链淀粉乳液在59.5～84.9 ℃出现最大吸热峰，峰值温度为76.6 ℃。这是由于直/支链白果淀粉随着温度的升高，淀粉分子之间的氢键断开，在水溶液内发生糊化所致。含水量小于5%的白果直链淀粉在66.55～144.22 ℃出现最大吸热峰，峰值温度为117.56 ℃；白果支链淀粉最大峰值在46.88～126.80 ℃，峰值温度为94.83 ℃。由于淀粉样品的分解温度在300 ℃以上，排除样品分解的可能性；且固体含有水分较少，无法糊化，因此所形成的峰为吸热脱除少量水分所致。

由起始温度(T0)、Tp和终止温度(Tc) 值可知，白果直链淀粉均高于支链淀粉。Tc-T0的变化反映淀粉颗粒内部结构的差异程度，Tc-T0越大表明差异程度越大[12]，直链淀粉Tc-T0值小于支链淀粉，这是因为直链淀粉内部结构趋向于紧密有序的方式排列、完善程度差异小的缘故。

图6 不同含水的白果淀粉DSC曲线

糊化焓指的是在给定温度下体系趋向于达到自由能最小的状态时，伴随着结构变化所发生的热焓的改变。Cooke 等[13]认为淀粉糊化焓主要反映的是双螺旋结构的破坏，而不是结晶体的破坏。由表1中可知，白果直链淀粉糊化焓大于支链淀粉糊化焓，则直链淀粉吸热量大于支链淀粉，说明白果直链淀粉中的双螺旋结构不易被破坏，热稳定性越好；相比之下支链淀粉稳定性略差，易受温度的影响。直支链淀粉峰值温度较木薯淀粉及马铃薯淀粉峰值均偏大[13]，白果淀粉糊化所需温度较高，故属较难于糊化淀粉。因此，在制备变性淀粉，淀粉糊化过程中，要保证足够的糊化时间。

表1 不同含水率的白果直链/支链淀粉的热特性参数

3 结 论

3.1 碘与白果直链淀粉络合呈蓝色，最大吸收峰620 nm处；与白果支链淀粉络合呈红紫色，最大吸收峰出现在560 nm处。白果直链淀粉纯度96.2%,支链淀粉纯度99.9%。

3.2 白果原淀粉、直链淀粉和支链淀粉在真空条件下干燥后，颗粒均在20 μm以下，且SEM显示天然白果原淀粉颗粒为椭圆状，提取后的白果直链淀粉及支链淀粉均无固定形状。

3.3 凝胶渗透色谱分析可知，白果直链淀粉由两种直链淀粉组成，分子质量分别为10.31和2.32 ku，白果支链淀粉分子质量为1 189.05 ku。

3.4 含水量为50%的白果直链淀粉乳液峰值温度(Tp)为138.23 ℃，支链淀粉乳液Tp为 76.6 ℃，均为糊化温度；含水量<5%白果直链淀粉热稳定性较好，Tp为117.56 ℃，支链淀粉Tp为94.83 ℃，均为脱残留水分的吸热峰。

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Extraction and Performance ofGinkgobilobaLinn.Amylase and Amylopectin

ZHANG Caihong1,2, HUANG Lixin1, XIE Pujun1, DENG Yejun1, CHEN Hongxia1

(1.Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF;National Engineering Lab. for Biomass Chemical Utilization;Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering,SFA;Key Lab. of Biomass Energy and Material, Jiangsu Province,Nanjing 210042, China; 2.Research Institute of Forestry New Technology,CAF, Beijing 100091, China)

Starch was extracted and separated fromGinkgobilobaLinn. Its amylase and amylopectin were purified and their performances, e.g. maximum absorption wavelength, DSC, SEM, were analyzed. The results indicated that maximum absorption wavelength on starch, amylase and amylopectin ofG.bilobawas 600, 620, and 560 nm separately by wavelength scanning from 400 nm to 800 nm. Their particles were less than 20 μm. The SEM images showed that the starch feature was ellipsoid and the amylase and amylopectin particles were not steady feature. The maximum endothermic peak of amylase and amylopectin with 50% water was 138.23 ℃ and 76.6 ℃.They were gelatinized. The maximum endothermic peak of amylase and amylopectin with less than 5% water were 117.56 ℃ and 94.83 ℃.They were dehydration peaks. The gel permeation chromatographic analysis(GPC) showed that the molecular weights of two amylases were 10.31 ku and 2.32 ku and the molecular weight of amylopectin was1 189.05 ku.

GinkgobilobaLinn.; amylase; amylopectin; SEM; DSC

2016- 10- 13

中国林科院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(CAFYBB2014QA021)；江苏省(基础研究计划)自然科学基金(BK20151067)；江苏省生物质能源与材料重点实验室基本科研业务费资金(JSBEM-S-201507)

张彩虹(1979— ), 女, 河北承德人, 硕士，助理研究员，主要研究方向为林果资源开发利用与新型干燥技术; E-mail: zchrainbow-chde@163.com

*通讯作者：黄立新, 研究员, 博士, 博士生导师，主要研究领域为天然产物化学研究及新型干燥技术；E-mail: l_x_huang@163.com。

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.04.015

TQ35;TQ920.9

A

0253-2417(2017)04-0103-07

张彩虹，黄立新，谢普军，等.白果直链/支链淀粉的分离及性能研究[J].林产化学与工业，2017，37(4)：103-109.