猪整合素αv多克隆抗体制备与应用

王恩雨，高晶，郭东华，李春秋，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

猪整合素αv多克隆抗体制备与应用

王恩雨，高晶，郭东华，李春秋，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

利用大肠杆菌原核表达系统对猪整合素αv基因片段进行表达，纯化目的蛋白免疫小鼠，制备猪整合素αv多克隆抗体，并对其进行鉴定及初步应用。对基因序列进行预测分析后，截取胞外区抗原性较好的基因片段，针对大肠杆菌稀有密码子优化后合成该基因序列，克隆至pGEX-6p-1原核表达载体上，诱导表达并纯化重组蛋白，对重组蛋白进行Western blot鉴定后免疫小鼠，制备多克隆抗体。利用间接ELISIA方法检测抗体效价，利用Western blot技术检测猪整合素αv多克隆抗体与天然整合素αv蛋白的反应原性。获得了分子质量为83 ku的重组蛋白，以纯化的重组蛋白作为免疫原制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400，且能识别天然整合素αv蛋白。研究成功制备了猪整合素αv多克隆抗体，为后续相关研究提供基础。

猪；整合素αv；多克隆抗体；重组蛋白；病毒受体

整合素是一类细胞表面蛋白由α和β亚基组成，α亚基和β亚基可以形成多种异源二聚体。α亚基中aD，aE，aL，aM，aX，a1，a2，a10，a11包含I结构域，通常它们的I结构域是配基结合位点。当α亚基不含I结构域时，如a3，a4，a5，a6，a7，a8，a9，av和aIIb，这些亚基的配基结合位点通常为β-螺旋区，并且和β亚基的I结构域结合在一起[1]，形成细胞外配体结合位点，它们可以识别配体上特定的氨基酸序列，多数为RGD序列。大量研究证实，多数病毒可利用整合素作为病毒受体或共受体，如人免疫缺陷病毒[2]、腺病毒[3]、汉坦病毒[4]、轮状病毒[5]、埃博拉病毒等[6]、口蹄疫病毒[7]。在病毒感染过程中，单独的β亚基不能发挥功能或者功能降低，需要α亚基与β亚基结合，促使β亚基发挥生理功能，整合素αv即是其中之一，如αvβ3能增强轮状病毒侵入细胞作用，αvβ6是口蹄疫病毒的共受体[8]。因此，整合素αv在介导病毒感染中起到重要的辅助作用。猪整合素αv在猪的肾、气管上皮、食管、甲状腺等组织中均有分布[9]，而猪整合素αv在介导病毒侵入方面研究甚少，因此，研究旨在制备猪整合素αv多克隆抗体为后续研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料与试验动物

E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）感受态细胞、pGEX-6p-1原核表达载体于本实验室保存；8周龄的Balb/c雌性小鼠购，自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，购自Sigma-Aldrich公司；IPTG，购自Biosharp公司；T4 DNA Ligase、XhoI和BamHI限制性内切酶、ExTaq DNA聚合酶，购自Fermentas公司；HRP标记羊抗鼠IgG，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；IRDye700DX羊抗鼠IgG，购自Li-COR公司；ECL发光液试剂，购自Biotopped公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，购自北京索莱宝生物技术有限公司。

1.2 合成基因与引物设计

参考GenBank中猪整合素αv的核苷酸序列（GenBank accession no.EF474019），利用CBS网站（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在线分析该氨基酸序列的疏水性，截取具有亲水性的胞外区氨基酸序列，通过DNAStar软件分析预测该氨基酸序列的主要抗原区，然后截取具有较好抗原性的部分氨基酸序列，优化针对大肠杆菌具有偏嗜性的密码子，分别在5'和3'末端加入BamHⅠ和XhoⅠ两种酶切位点，人工合成了αv基因的核苷酸序列。将合成的基因连接至pGH载体上，该合成质粒pGH-αv由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。利用Primer 5.0软件设计1对引物（表1）。

表1 猪整合素αv基因扩增引物Table 1Primers for the amplification of porcine integrin αv

1.3 目的蛋白表达与纯化

对合成质粒pGH-αv和pGEX-6p-1载体分别进行BamHI和XhoI双酶切，酶切后目的片段利用胶回收试剂盒进行胶回收，然后将两片段利用T4 DNA连接酶进行连接，并将其转化入E.coli DH5α感受态细胞中。随机挑取十个单菌落，利用上述引物进行菌落PCR鉴定，将筛选出的阳性菌提取质粒备用。将提取的质粒转化入E.coli BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落于LB液体培养基（100 μg·mL-1Amp+）中培养，当OD600的值达到0.6时，用IPTG（1 mmol·L-1）诱导4 h，然后利用SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白的表达。用预冷的0.1 mmol·L-1KCl浸泡胶至条带呈乳白色，然后将含有目的蛋白的凝胶切下，装入含有1×电泳液的透析柱中，100 V洗脱1 h，获得纯化的目的蛋白。

1.4 重组蛋白的抗原性分析

将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印至硝酸纤维膜（NC膜）上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h。以GST单克隆抗体（mAb）为一抗（1∶3 000），孵育2 h，PBST洗3次，每次10 min，以山羊抗鼠HRP-IgG为二抗（1∶2 000）孵育1 h，PBST洗3次，每次10 min，将NC膜置于Super ECL Plus超敏发光液中，用扫描成像系统进行扫描。

1.5 重组蛋白抗体的制备

将纯化后蛋白按照一定比例与弗氏佐剂等体积混合，充分乳化后，按50 g/只的剂量于皮下、腹腔多点注射。首次免疫用弗氏完全佐剂，二免和三免用弗氏不完全佐剂，对照组为健康小白鼠。每次免疫间隔14 d，三免三日后进行眼球采血，获得血清。

1.6 重组蛋白抗体效价检测

以终浓度为1 μg·mL-1的重组蛋白包被96孔板，每孔100 μL，4℃包被过夜，用5%的脱脂乳37℃封闭2 h，以待测血清为一抗，并利用用方阵法确定血清稀释度，以非免疫健康小鼠血清为阴性对照，37℃孵育2 h，以山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，37℃孵育2 h，洗涤后进行TMB显色，避光显色10 min后加2 mol·L-1H2SO4终止。用酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度值。

1.7 重组蛋白抗体的Western blot鉴定

利用含有天然整合素αv蛋白的猪睾丸细胞（ST细胞）、猪肾细胞（PK15细胞）、猪小肠黏膜上皮细胞（IEC细胞）及仔猪小肠组织，分别提取细胞总蛋白，样品处理后进行SDS-PAGE电泳，转印至NC膜上，用5%的脱脂乳室温封闭2 h。用制备的猪整合素αv多克隆抗体作为一抗（1∶200），室温孵育2 h。以IRDye700DX羊抗鼠IgG为二抗（1∶5 000），孵育1 h，PBST洗膜30 min。采用红外荧光扫描成像系统采集图像，进一步验证制备的猪整合素αv多克隆抗体是否与天然整合素αv蛋白具有反应原性。

2 结果

2.1 原核表达及纯化结果

利用CBS网站对猪整合素αv胞外区进行分析，通过DNAStar软件分析猪整合素αv胞外区的主要抗原区，进一步利用原核表达载体pGEX-6p-1对猪整合素αv胞外区主要抗原区进行表达与纯化。结果表明，猪整合素αv胞外区第37～557位氨基酸具有较好的抗原性，该基因经密码子优化合成后，克隆到原核表达载体pGEX-6p-1。重组质粒pGH-αv用BamHI和XhoI进行双酶切，获得了2 907 bp和1 587 bp两个片段，与预期大小相符（图1）。重组质粒pGEX-6p-1-αv菌液以IPTG诱导后，经SDSPAGE电泳分析，在83 ku处可见特异性的表达条带，与预期条带大小一致。表达的细菌超声破碎后，经SDS-PAGE电泳，结果显示目的蛋白存在于沉淀中，表明蛋白以包涵体的形式存在。通过切胶纯化，获得了纯化蛋白（图2）。

图1 猪整合素αv合成质粒双酶切鉴定结果Fig.1Enzyme digestion of porcine integrin αv synthetic plasmid

图2 重组蛋白表达和纯化结果Fig.2The result of expression and purification of recombination protein

2.2 重组蛋白的抗原性分析

纯化后的重组蛋白经Western blot方法分析，以鼠源GST单克隆抗体（mAb）为一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，在重组蛋白及标签蛋白大小位置分别有特异性条带，明确获得的纯化蛋白为目的蛋白（图3）。

图3 纯化蛋白Western blot鉴定结果Fig.3The purified protein Western blot identification

2.3 多克隆抗体效价检测

将重组蛋白倍比稀释后包被96孔板，以不同稀释倍数的小鼠血清为一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG为二抗，用间接ELISIA方法检测制备的多克隆抗体效价大于1∶6 400。

2.4 抗体鉴定结果

对含有天然整合素αv蛋白的IEC细胞、ST细胞、PK15细胞、Vero E6细胞及仔猪小肠组织的膜蛋白进行Western blot分析，结果ST细胞、IEC细胞、及仔猪小肠组织蛋白均在130 ku左右有一条特异性条带，与整合素αv蛋白大小相近，另外PK15细胞蛋白与其他3种蛋白在55～100 ku之间有多条条带，此结果说明制备的多克隆抗体能识别多种天然的整合素αv蛋白（图4）。

图4 Western blot鉴定多抗对天然整合素αv蛋白的识别Fig.4The identification of polyclonal antibody with natural integrin αv protein by western blot

3 讨论

1987年自发现整合素受体家族以来[10]，研究学者们认为整合素是有效的细胞粘附受体。整合素与其配体在免疫反应、止血、白细胞转运、人类遗传和癌症或自身免疫疾病等方面有着至关重要的作用。整合素可作为血栓和炎症治疗药物的靶蛋白，同时还可作为细菌和病毒的感染受体。由于整合素αv缺失I结构域，所以必然会借助共价键与β亚基形成异源二聚体，同时也能增强β亚基的生物学功能，牟丹蕾等[11]也证实αvβ3共转染CHO细胞后，能有效的提高蛋白在细胞膜上的表达。在验证多克隆抗体时，不同的细胞或组织蛋白在NC膜上出现了多个条带，并且条带之间存在一定的差异性，这或许是α亚基与β亚基形成的二聚体，在不同组织或细胞中含有的二聚体及其空间构象均有所不同，它们可以共定位在细胞膜表面，在裂解细胞时没有完全分开，还有可能是在胞内合成未成熟的蛋白，在裂解细胞时释放出来。

研究成功构建了猪整合素αv截短基因原核表达系统[12]，利用纯化的表达蛋白免疫小鼠后获得血清，进一步验证了制备的血清能识别4种不同组织或细胞中的整合素αv。目前，市面上没有销售猪整合素αv商品化抗体。因此，研究制备的猪整合素αv多克隆抗体为病毒与受体互作等研究提供基础。

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Preparation and Application of Polyclonal Antibody against Porcine Integrin αv

Wang Enyu，Gao Jing，Guo Donghua，Li Chunqiu，Sun Dongbo
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Construction of prokaryotic expression vector of porcine integrin αv gene，purification of fusion protein which was used to immunize mice to prepare and then to identify and apply the polyclonal antibody against porcine integrin αv gene.The extracellular domain and antigenicity gene sequence of porcine integrin αv was truncated after prediction and analysis.The gene sequence was synthesized according to optimize the Escherichia coli rare codon and cloned into the pGEX-6p-1 prokaryotic expression vector.The recombinant protein was expressed and purified and then identified by western blot which was immunized mice to prepare polyclonal antibody.The antibody titer was used indirect ELISIA method to detect，and then detect the response of natural integrin αv protein by Western blot.The 83 ku molecular weight recombinant protein was obtained.The polyclonal antibody titer was more than 1∶6 400 which was prepared by the purified of recombinant protein and it was able to react with native integrin αv protein.The polyclonal antibody against porcine integrin αv was prepared which provided some basis for following further related research.

pig;integrin αv;polyclonal antibody;recombinant protein;virus receptor

TS214.9

A

1002-2090（2017）04-0041-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.010

2017-01-15

国家自然科学基金面上项目（31472209）。

王恩雨（1993-），女，黑龙江八一农垦大学动物科技学院2015级硕士研究生。

孙东波，男，教授，博士研究生导师，E-mail：dongbosun@126.com。