果蝇Cullin 5基因dsRNA设计及RNAi效率检测

何倩毓，张原熙，刘胜军，孙蕊，张莹

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.大庆市环保局环境监测中心站）

果蝇Cullin 5基因dsRNA设计及RNAi效率检测

何倩毓1，张原熙2，刘胜军1，孙蕊1，张莹1

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.大庆市环保局环境监测中心站）

Cullin 5作为Cullin蛋白家族的一员对调控细胞内蛋白降解有着重要意义。为便于深入研究果蝇中Cullin 5基因的功能，对Cullin 5基因的5’UTR区域进行dsRNA设计，并通过PCR和体外转录获得相应的dsRNA。利用RNA干扰以及Realtime PCR检测得到该dsRNA的RNAi效率。结果表明设计及合成的Cullin 5基因的dsRNA可显著降低Cullin 5的转录水平（P＜0.01），与对照组相比较，其mRNA水平下降至27%，表明该dsRNA具有RNA干扰效果。该实验将为今后研究果蝇Cullin 5基因的功能提供一定的技术支持。

黑腹果蝇；Cullin 5；dsRNA；RNA干扰；Real-time PCR

细胞内外的大多数蛋白质在生物体生长发育的过程中处于不断更新的状态，即不断地被降解和被新合成的蛋白质取代。蛋白的降解在细胞的生理活动中发挥着不可替代的作用，一旦其发生异常将导致许多疾病，如肿瘤、神经退行性疾病等。细胞内蛋白的降解主要通过两个途径，即细胞自噬（Autophagy）和泛素蛋白酶体系统（Ubiquitin proteasome system，UPS）。其中UPS负责特异性地降解大多数细胞内蛋白，它是一种高效的蛋白降解途径，其生物学作用非常广泛。UPS通过降解生物体内的关键蛋白可以精细调控着细胞中的许多信号通路和生理过程，如DNA复制、细胞周期、DNA损伤修复、肿瘤抑制、生长发育、信号转导、转录调节等[1-2]。

UPS特异性降解蛋白过程中起决定性作用的是E3泛素连接酶。由Cullin蛋白组成的Cullin-Ring Ligase（CRL）所调控的降解事件，在其中占有相当大的比例。CRL复合体是由含RING结构域的催化亚基（如ROC1、ROC2）、Cullin骨架蛋白、接头蛋白（如SKP1，ElongB/C，DDB1等）以及底物识别亚基（如F box，DCAF等）这四个部分组成。CRL复合体中所包含的Cullin骨架蛋白的不同决定了构成CRL的RING亚基、接头蛋白以及底物识别亚基的不同及特定的功能。在人类基因组中共存在7种Cullin蛋白，分别是Cullin 1、Cullin 2、Cullin 3、Cullin 4A、Cullin 4B、Cullin 5及Cullin 7[3-4]。已有研究表明Cullin 5与神经突触的形成以及卵细胞的发生有关[5-6]，而且这种功能可能是通过激活MPK-1的信号通路来完成的。此外研究发现，Cullin 5与分子伴侣Hsp90的底物蛋白的活性密切相关，Cullin 5可通过在分子水平和细胞水平上调控Hsp90抑制剂诱导的癌基因的降解及生物活性的丧失[7-8]。为了深入探寻Cullin 5的生理功能及具体的调控机制，研究拟在果蝇这一模式昆虫中针对果蝇基因组中的Cullin 5基因设计及合成dsRNA，研究将为下一步阐明Cullin 5的功能提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用果蝇Kc细胞由东北林业大学林学院邹传山老师实验室提供。使用添加5%胎牛血清（Fetal bovine serum，South American Origin，Hyclone）的Schneider果蝇细胞培养基（Schneider’s Drosophila Medium 1X，liquid，Gibco，Invritogen），在27℃生化培养箱中培养。当细胞密度达到106mL-1时，以1∶5的比例转移到新鲜培养基。

1.2 主要试剂

T7体外转录试剂盒（由普洛麦格生物技术有限公司提供）；Real-time PCR试剂盒（由宝日医生物技术有限公司提供）；其余试剂为实验室常规所备试剂。

1.3 dsRNA设计及引物合成

根据Flybase上发布的Cullin 5基因信息（Flybase ID：FBgn0039632）设计dsRNA。dsRNA设计的原则：dsRNA长度在500 bp左右，且通过BLAST比对不能与果蝇基因组中其他基因有超过19 bp的同源性。根据确定的dsRNA合成区域的核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0.软件设计Cullin 5的PCR引物以及对照基因EGFP的PCR引物，并在每一对引物的5’末端加上T7启动子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGG，作为最终PCR扩增引物。具体引物序列见表1。引物合成委托上海生工公司完成。

表1 dsRNA合成引物序列及扩增产物大小Table 1Primers used for dsRNA synthesis and the size of the dsRNAs

1.4 双链DNA的扩增

采用Trizol法提取果蝇Kc细胞的RNA，并利用M-MLV酶反转录成cDNA[9]。分别以果蝇Kc细胞的cDNA以及pEGFP-N1质粒为模板，表1中的引物进行Cullin 5、EGFP双链DNA的PCR扩增。扩增产物凝胶分析后进行胶回收，并测序鉴定。鉴定成功后，每个基因的多管PCR胶回收产物进行浓缩使其浓度达到合成dsRNA的要求。浓缩方法：将多管PCR胶回收产物合并一管后，加入0.1倍体积3 M醋酸钠（pH=5.2）和1倍体积的异丙醇，混匀，置于冰上5 min后，4℃12 000 rpm离心30 min，弃上清，加500 μL预冷的75%乙醇，4℃12 000 rpm离心10 min，弃上清干燥5 min后加30 μL无RNA酶污染的水溶解，-20℃保存待用。

1.5 dsRNA的合成

以浓缩后的双链DNA为模板，采用T7体外转录试剂盒分别合成Cullin 5和EGFP的dsRNA，具体步骤按说明书操作并根据实际情况进行微调。

1.6 RNAi干扰实验

向12孔细胞培养板内以2×105密度接种果蝇的Kc细胞，12 h后，分别加入实验组Cullin 5和对照组EGFP的dsRNA，每组dsRNA的加入量均为5 μg/mL，每组三个实验重复，孵育48 h后，收集细胞。

1.7 Real-time PCR检测RNAi效率

分别收集各dsRNA处理的Kc细胞，提取RNA后并反转录成cDNA，稀释10倍后采用TOYOBO的SYBRGreen Realtime Master Mix（TOYOBO，Cat. OPK-201）进行Real-time PCR。以果蝇rp49作为内参基因，采用2-△△ct法分析目的基因的相对表达水平，每个样品重复进行三次，取各组数据的平均值和标准误，并将实验结果绘制成柱形图。表2为Realtime PCR涉及到的引物。

1.8 统计分析

实验结果采用SPSS 16.0“Independent Samples T-Test”分析。“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

表2 Real-time PCR引物序列及扩增产物大小Table 2Primers used for Real-time PCR and the size of the products

2 结果

2.1 双链DNA扩增结果

分别以果蝇Kc细胞的cDNA以及pEGFP-N1质粒为模板，利用表1引物进行PCR扩增，合成双链DNA。经电泳检测获得目的大小的特异性条带（图1）。胶回收产物测序后BLAST比对确认为目的片段。

图1 Cullin 5基因以及EGFP基因dsRNA区域对应的DNA PCR产物电泳结果Fig.1The electrophoresis result of DNAs corresponding to the dsRNA regions of Cullin 5 and EGFP

2.2 dsRNA合成结果

以浓缩后的双链DNA为模板，利用T7体外转录试剂盒分别合成EGFP-dsRNA以及Cullin 5-dsRNA，合成后的dsRNA稀释100倍进行琼脂糖凝胶电泳。通过凝胶成像系统分析得到如图2所示的特异的、与目的大小一致的单一条带。

2.3 Cullin 5基因dsRNA的RNAi效率检测及分析

为分析合成的Cullin 5-dsRNA是否有效，将dsRNA转入Kc细胞中，孵育48 h后收集细胞，提取RNA并反转录成cDNA后利用Real-time PCR检测Cullin 5基因的表达。实验结果表明Cullin 5-dsRNA处理的Kc细胞中Cullin 5基因的表达显著下降（P＜0.01），与EGFP-dsRNA处理组相比较，其mRNA水平下降至27%（图3）。

3 讨论

作为E3泛素连接酶家族中的一员，Cullin 5最早在人胚胎肾细胞293T中被发现参与Hsp90抑制剂格尔德霉素诱导的ERBB2的降解[7]。近期研究发现除调控ERBB2的降解，Cullin 5还参与调控众多蛋白激酶的泛素化及降解，如BRAFV600E，AKT以及CDK4等[8]。Cullin 5主要是通过结合Elongin B/C以及SOCSbox来识别特异性底物，完成泛素从E2到底物之间的传递过程。人类基因组中存在大约30个SOCS蛋白，那么在Cullin 5降解不同的底物过程中如何选择性结合特异的SOCS蛋白来发挥其功能目前尚不清楚。到目前为止只有少数几个的SOCS蛋白的功能被鉴定。有报道发现，Cullin 5和HIV蛋白病毒体感染因子Vif（HIV protein virion infectivity factor，一种SOCSbox蛋白）能够形成CRL5 E3连接酶，这种E3连接酶可以特异的介导人的抗病毒蛋白APOBEC3G的降解[10]。

图2 Cullin 5基因以及EGFP基因dsRNA电泳结果Fig.2The electrophoresis result of dsRNAs targeted to Cullin 5 and EGFP

图3 Cullin 5 RNAi效率检测Fig.3Detection of the RNAi effeciency of Cullin 5

到目前为止，Cullin 5的功能研究较少，尚无人建立相关的Cullin 5小鼠模型体系进行研究，仅在秀丽线虫及果蝇等模式生物中发现Cullin 5与神经突触的形成以及卵细胞的发生有关[5-6]。为了便于今后有效地研究Cullin 5的功能，实验利用果蝇这一模式生物，针对果蝇基因组中的Cullin 5基因设计合适的RNA干扰区域，并利用细胞RNAi技术和Real-time PCR方法检测干扰效率，结果显示所设计及合成的Cullin 5-dsRNA可使果蝇Kc细胞中Cullin 5的转录水平下降至对照组的27%。研究成果将为日后进一步研究Cullin 5的功能提供了强有力的技术保障。

［1］Bernassola F，Karin M，Ciechanover A，et al.The HECT family of E3 ubiquitin ligases：multiple playersin cancer development［J］.Cancer Cell，2008，14：10-21.

［2］Yang H，Landis-piwowar KR，Chen D，et al.Natural compounds with proteasome inhibitory activity for cancer prevention and treatment［J］.Curr Protein Pept Sci，2008（3）：227-2396.

［3］蒋雨函，许广波，梁运江，等.鸡爪苓菌丝体与子实体的全长cDNA文库构建及部分EST序列分析［J］.延边大学农学学报，2016（4）：277-282.

［4］刘相元，胡弘历，欧阳华芳，等.CRL E3泛素连接酶复合体研究进展［J］.中国细胞生物学学报，2014，36（2）：157-168.

［5］Sasagawa Y，Sato S，Ogura T，et al.C.elegans RBX-2-CUL-5-and RBX-1-CUL-2-based complexes are redundant for oogenesis and activation of MAP kinase MPK-1［J］.FEBS Lett，2007，581（1）：145-150.

［6］Ayyub C，Sen A，Gonsalves F，et al.Cullin-5 plays mutiple roles in cell fate specification and synapse formation during Drosophila development［J］.Dev Dyn，2005，232（3）：865-875.

［7］Ehrlich E S，Wang T，Luo K，et al.Regulation of Hsp90 client proteins by a Cullin5-RING E3 ubiquitin ligase［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（48）：20330-20335.

［8］Samant R S，Clarke P A Workman P.E3 ubiquitin ligase Cullin-5 modulates multiple molecular and cellular responses to heat shock protein 90 inhibition in human cancer cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（18）：6834-6839.

［9］岳璐，李昆鹏，侯喜林，等.重组PEDV-S干酪乳杆菌的构建及其表达［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2016，28（2）：76-79.

［10］Yu X，Yu Y，Liu B，et al.Induction of APOBEC3G ubiquitination and degradation by an HIV-1 Vif-Cul5-SCF complex［J］.Science 2003（5647）：1056-1060.

Design of dsRNA Regions for Drosophila Cullin 5 Gene and Detection of the RNAi Efficiency

He Qianyu1，Zhang Yuanxi2，Liu Shengjun1，Sun Rui1，Zhang Ying1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Environmental Monitoring Center Station，Daqing Environmental Protection Agency）

As one of the members of Cullin proteins family，Cullin 5 played an important role in regulation of protein degradation.To facilitate the further studies on the function ofCullin5 inDrosophila，dsRNA targeted to the 5’UTR region of Cullin 5 was designed，and synthesized by PCR and the in vitro transcription methods.Then the RNAi efficiency was detected through RNAi and Real-time PCR.The results showed that the transcriptional level ofCullin 5was reduced significantly by the dsRNA ofCullin 5synthesized in this study（P＜0.01），and the mRNA level decreased to 27%compared to that in the control group.This study could provide strong technical support for the study on function ofCullin 5inDrosophilain the future.

Drosophila melanogaster；Cullin 5；double strand RNA；RNA interference；real-time PCR

TS214.9

A

1002-2090（2017）04-0037-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.009

2017-01-12

黑龙江省自然科学基金项目（C2016040）；黑龙江八一农垦大学学成、引进人才科研启动项目（XYB2015-07）。

何倩毓（1986-），女，讲师，中科院上海生命科学研究院毕业，现主要从事动物遗传育种方面的研究工作。