黄葵胶囊通过抑制缺氧诱导因子改善单侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化的机制

钟正霞 裘志成

(遵义医学院附属医院肾内科，贵州 遵义 563000)

黄葵胶囊通过抑制缺氧诱导因子改善单侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化的机制

钟正霞 裘志成

(遵义医学院附属医院肾内科，贵州 遵义 563000)

目的研究黄葵胶囊是否可以通过抑制缺氧诱导因子(HIF)-1α的表达改善单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型的肾间质纤维化情况。方法将54只雄性成年Sprague-Dawley大鼠随机分组，每组18只，分为对照组(即假手术组，Sham组)、单侧输尿管结扎建立的肾纤维化模型组(UUO组)和模型+黄葵胶囊治疗组(HK组)，UUO组及HK组大鼠进行左侧输尿管结扎建模，术后1 d起，HK组按照1 g/kg的剂量用黄葵胶囊进行灌胃，1次/d；Sham组及UUO组每天以等量生理盐水进行灌胃。治疗后第7、14天，分别处死各组中的9只大鼠，取左侧肾脏组织，HE染色进行肾脏组织病理检查及损伤评分，实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测肾脏组织中HIF-1α mRNA和蛋白的表达。结果UUO组与HK组术后均出现了肾脏局部的病理损害，但HK组肾损伤明显较轻，各时间点HK组肾小管间质损伤指数与UUO组相比显著降低；术后7 d与14 d，UUO组及HK组中的HIF-1α mRNA及蛋白表达水平均较Sham组显著升高，而HK组中的HIF-1α mRNA及蛋白水平均显著低于UUO组。结论黄葵胶囊可以通过降低肾纤维化模型中HIF-1α的水平缓解病情，修复肾损伤，是一种有效的抗肾间质纤维化药物。

黄葵胶囊；单侧输尿管梗阻；肾间质纤维化;缺氧诱导因子-1α

慢性肾衰竭(CRF)是多种肾病晚期的转归。肾间质纤维化(RIF)与CRF的发生与发展存在着紧密的关联〔1〕。缺氧诱导因子(HIF)-1α是参与肾纤维化发生的重要分子〔2〕，肾脏损伤可能引起肾局部缺氧，造成HIF-1α上调，进而影响其下游靶基因的表达，而其中就包括了许多被异常激活的纤维化基因，最终引起RIF的发生〔3〕。黄葵胶囊是一种中药制剂，多年来临床研究已经证实其具有肾脏保护、修复功能，对于多种肾脏疾病均有较好的疗效〔4〕。本项研究建立由单侧输尿管梗阻(UUO)引起的大鼠RIF模型，进而探讨黄葵胶囊是否可以通过抑制HIF-1α的表达改善UUO大鼠模型的RIF情况，发挥其抗纤维化的功效。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂 雄性成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重200～220 g)共54只购自南京君科生物工程有限公司，黄葵胶囊购自江苏苏中药业有限公司，Trizol 试剂购自美国Thermo scientific 公司，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ购自宝生物工程(大连)有限公司，兔抗大鼠HIF-1α抗体、GAPDH抗体，HRP 标记二抗购自美国Abcam公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，RIPA裂解液、BCA蛋白测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司，引物购自上海生工，序列：HIF-1α 上游引物5′-CAAGATCTCGGCGAAGCAA-3′，下游引物5′-GGTGAGCCTCATAACAGAAGCTTT-3′；GAPDH上游引物5′-TTCTAGAGACAGCCGCATCT-3′，下游引物5′-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3′。

1.2UUO模型的建立及实验分组 将SD大鼠随机分为对照组(即假手术组，Sham组)、单侧输尿管结扎建立的肾纤维化模型组(UUO组)和模型+黄葵胶囊治疗组(HK组)每组18只。UUO组及HK组大鼠进行建模〔5〕：使用30 mg/kg巴比妥钠进行腹腔注射麻醉后，切开腹腔左侧暴露左输尿管，沿上端结扎两道后缝合腹腔，而Sham组不结扎即进行缝合。于术后1 d起，HK组按照1 g/kg的剂量用黄葵胶囊灌胃，1次/d。Sham组及UUO组每天以等量的生理盐水灌胃。在手术后的第7、14天，各组随机选取9只大鼠处死，解剖后摘取左肾，分成2份，一份浸泡于10%甲醛液中固定后，用于蜡块包埋和HE染色；其余组织于液氮中冻存，用于检测组织中mRNA和蛋白的表达水平。

1.3肾脏组织病理检查及损伤评分 苏木精-伊红(HE)染色后的切片在光镜下观察肾脏的病理损害程度，并以病变部分占染色总面积的百分比进行评分。评分共分为4级，其中0分表示正常，无病变发生，病变范围<25%计为1分，表示轻度损伤，病变范围25%～50%计为2分，表示中度损伤，病变范围>50%计为3分，表示重度损伤。

1.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测HIF-1α在肾脏组织中的表达 使用Trizol试剂提取肾脏组织中的总RNA，然后使用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒，按照说明书进行RT-qPCR扩增。HIF-1α的表达以参照基因GAPDH的表达作为内参，采用△△CT法进行计算，即△CT = HIF-1α基因 CT 值-GAPDH基因CT值，两组表达倍数差异=2-△△Ct(△△CT =组1△CT -组2△CT)。

1.5蛋白免疫印迹法检测肾脏组织中HIF-1α蛋白的表达 冻存的样品经聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳进行蛋白分离，之后将SDS凝胶上的蛋白采用湿转法转移到PVDF膜上，然后加入含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液(即封闭液)，在室温条件下置于摇床上，进行2 h的封闭后，倒去封闭液，用TBST缓冲液洗膜后加入一抗(HIF-1α抗体及GAPDH抗体)4℃孵育过夜。第2天，用TBST缓冲液洗膜后，加入二抗孵育，再次洗膜后，加入ECL化学发光试剂进行发光显色。

1.6统计学方法 使用SPSS19.0软件，组间计量资料比较使用t检验，计数资料比较使用χ2检验，多组间数据比较使用单因素方差分析法(one-way ANOVA)。

2 结 果

2.1肾脏组织病理检查及损伤评分 HE染色结果显示Sham组术后7 d与14 d未见显著异常病理改变，而UUO组与HK组术后7 d均出现了局部肾小管坏死、炎性细胞浸润、胶原纤维增生及纤维化；而到了术后14 d时，这两组中以上表现更显著。而与同时间UUO组相比，HK组中大鼠肾损伤明显较轻。在术后7 d与14 d，HK组肾小管间质损伤指数(TIDS)(1.11±0.56，1.44±0.50)与UUO组(1.77±0.62，2.11±0.57)相比均显著降低，但与Sham组(0.33±0.47，0.22±0.42)相比仍显著较高(P<0.05)。

2.2HIF-1α mRNA在各组大鼠肾脏组织中的表达 术后7 d，Sham组中HIF-1α mRNA表达(1.00±0.31)较低，UUO组(7.22±2.68)及HK组(5.51±2.65)中的HIF-1α mRNA水平均较Sham组显著升高(均P<0.05)，而HK组中的HIF-1α mRNA水平则显著低于UUO组(P<0.05)。术后14 d，UUO组(9.80±4.96)及HK组(6.46±2.46)中的HIF-1α mRNA水平仍显著高于Sham组(1.00±0.32)(均P<0.05)，而HK组中的HIF-1α mRNA水平仍显著低于UUO组(P<0.05)。

2.3各组大鼠肾脏组织中HIF-1α蛋白的表达 术后7 d及14 d，Sham组中HIF-1α蛋白表达均较低，UUO组及HK组中的HIF-1α蛋白水平均较Sham组显著升高，而HK组中的HIF -1α的蛋白水平低于UUO组。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织中HIF-1α蛋白的表达

3 讨 论

有研究表明，缺氧可能是造成梗阻性肾病发生发展的一个重要的独立因素〔5〕，其机制可能是因为缺氧造成了肾脏局部氧气及其他营养物质的减少，进而引起了肾小管细胞的异常凋亡以及RIF，最终导致了肾小管病变并随着其程度的不断加深造成肾单位丧失〔6〕。HIF-1是一种转录因子，在缺氧条件下，HIF-1可以与缺氧反应元件(HRE)进行结合，对其下游靶基因进行调控并产生效应〔7～9〕。HIF-1由α及β两个亚单位组成，而其中的 HIF-1α 是其主要的活性亚基，可能参与RIF的发生，并在肾纤维化的发展中起到至关重要的作用〔10〕，本次研究说明，在UUO模型组的肾脏中的确产生了局部的缺氧状况，而之前的观点认为，这种局部缺氧的状况很可能是因为对输尿管结扎导致了肾脏局部组织内的血液流动不畅，进而产生了血液循环方面的障碍。值得注意的是，在随着输尿管结扎时间的延长，其肾脏病变组织中HIF-1α的表达也呈现出增加的趋势，这一点进一步证实随着缺氧时间的增加，HIF-1α 的水平也逐渐升高，并且造成了肾脏的进一步损伤及纤维化。

黄葵胶囊是黄蜀葵花的提取物，其中的主要有效成分包括槲皮素、梅斗皮素、金丝桃苷、杨梅黄素等〔11〕。之前的多项研究已经证实，黄蜀葵花及其提取物具有广泛的杀菌、抗氧化、抗炎及抗血小板聚集作用。在肾病治疗领域，其治疗效果更为突出，黄葵胶囊可有效改善肾病患者的蛋白尿状况，抑制肾小球的炎症反应，从而修复肾小球损伤并改善其肾功能〔12〕。在本项研究中，我们发现使用黄葵胶囊对UUO大鼠进行治疗后，其肾纤维化状况得到了明显改善，证实黄葵胶囊可能通过下调HIF-1α 的表达改善局部因缺氧造成的炎性反应，减少活性氧的累积，对局部的肾脏损伤起到修复和保护作用，进而延缓RIF的进一步发展。

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6Du R，Xia L，Ning X，etal.Hypoxia-induced Bmi1 promotes renal tubular epithelial cell-mesenchymal transition and renal fibrosis via PI3K/Akt signal〔J〕.Mol Biol Cell，2014；25(17)：2650-9.

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12焦 贺，邢夏囡，宋文刚.黄葵胶囊对大鼠肾小管间质纤维化及PTEN的影响〔J〕.文摘版：医药卫生，2015；(10)：299-300.

〔2016-12-07修回〕

(编辑 徐 杰)

遵义医学院硕士启动基金〔院字(2012)10号〕

钟正霞(1979-)，女，硕士，主治医师，主要从事肾病风湿病研究。

R692.3

A

1005-9202(2017)16-3952-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.019