甘蔗叶片中原花青素含量测定及提取工艺的研究

石景雨，何丽莲，王先宏，刘鲁峰，陈疏影，李富生

（云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201）

甘蔗叶片中原花青素含量测定及提取工艺的研究

石景雨，何丽莲，王先宏，刘鲁峰，陈疏影，李富生*

（云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201）

以云南农业大学自育甘蔗品种“滇蔗01-58”为试验材料，优化原花青素的提取工艺，并对比不同类型的甘蔗品种叶片中原花青素的含量。得到结论，原花青素最高提取率的工艺组合为：提取时间40min、提取温度40℃、乙醇浓度90%、料液比是1∶10，萃取率为1.181%。测定的10个甘蔗栽培种和10个甘蔗野生种存在差异，其中栽培种叶片中原花青素提取率最高的是滇蔗09-38，野生种叶片中含量最高的是割手密Ⅰ9-56，总体表现为野生种叶片中原花青素的含量高于栽培种。

甘蔗；栽培种；野生种；叶片；原花青素含量；提取率

甘蔗作为制糖作物，其生物产量很高。中国是全世界种植甘蔗最早的国家[1]，目前产量居全世界第三。同时，甘蔗在生长的过程中长势迅速，对于土壤的适应性很强，是一种喜温，喜光植物[2]。甘蔗叶片是甘蔗制糖的副产物，占到甘蔗总产量的15%以上[3]。甘蔗中含有多种抗氧化物质，包括黄酮类化合物、酚类、甾醇、原花青素和儿茶素等[4]。

原花青素是一类缩合鞣质[5]，在自然界中，很多植物都具有原花青素这种化合物，原花青素主要分布在果核、果皮、种子等部位，在植物中具有很强的生物活性[6]。原花青素具有比较强的抗氧化及清除自由基作用[7]，原花青素在心脑血管中主要表现对血管的保护作用[8]，而且原花青素在抑菌抗炎方面表现出良好的作用，受到外界的影响比较小，具有稳定性[9]，原花青素能够减轻由于化疗所引起的骨髓抑制、免疫抑制的作用，并且能够减轻肝损伤[10]；除了这几个方面的作用，原花青素在其他方面也表现出非常良好的活性，如抗溃疡[11]、抗肿瘤[12]、对免疫系统的作用[13]等。甘蔗叶片中也含有一些原花青素，目前对于甘蔗叶片中原花青素含量的研究仅限于定量分析，但对于原花青素提取工艺方面的研究较少。本试验选用云南农业大学自育甘蔗品种“滇蔗01-58”作为试验材料，研究甘蔗叶片中原花青素的提取工艺，并对不同类型甘蔗品种间叶片中原花青素的含量进行分析。为进一步对甘蔗叶片中化合物的有效利用提供理论依据。

对于植物的抗氧化物质的提取方法主要基于水提法和有机溶剂提取法，根据研究表明，水提法对物质的提取效率不如有机溶剂提取法。有机溶剂法提取使用的有机溶剂主要有：甲醇、乙醇、丙酮等，考虑乙醇溶剂的安全无毒，且价格低廉，容易回收等特点，故采用乙醇对原花青素进行提取。综合考虑主要对原花青素提取率的影响因素，主要考虑乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比对原花青素提取效率的影响。在单因素的试验基础上，进行正交试验，可以得到原花青素的提取最佳工艺组合（即乙醇浓度、提取温度、提取时间和料液比的工艺组合），在这个工艺组合下，对不同类型的甘蔗品种叶片中原花青素进行提取，并进行对比分析。从而为甘蔗叶片的工厂化生产提供理论研究基础，可以延长甘蔗的产业链。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料为20种不同类型的甘蔗植株，其中10种为甘蔗栽培品种（系），10种为甘蔗野生种（见表3）。材料均种植于云南农业大学甘蔗资源圃，该资源圃位于昆明黑龙潭，云南农业大学校园内，海拔1930 m，试验材料为成熟期叶片。材料的选择上，选择正常、无病，代表成熟的甘蔗种植，+1叶片（最上一片完全叶）。

1.2 试验试剂和设备

主要试剂：原花青素（标准品），美国simga公司；甲醇；香草醛；浓盐酸；乙醇；去离子水等。主要仪器：紫外分光光度计（Agilent Technologies公司）、电子天平、打碎机、恒温水浴锅等。

1.3 试验方法

试验采用乙醇浸提法对原花青素进行提取。首先在不同的提取条件下，对“滇蔗01-58”甘蔗叶片中原花青素的提取率进行研究，筛选出最佳的提取范围。在这个范围基础之上，进行正交试验，优化这4个因素的交互作用。从而得到最佳的提取工艺组合。

1.3.1 原花青素标准曲线的绘制称取原花青素10mg，加入10 mL的甲醇，配置成溶液浓度为1.0mg/mL的原花青素母液，配置0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的标准溶液，分别取不同浓度的标准溶液1.0mL，加入6.0mL的4%香草醛-甲醇溶液和3.0mL浓盐酸，摇匀，在室温下静置15min，以浓度为0 mg/mL的原花青素标准溶液为空白，在500nm的波长处测定吸光值，以吸光度作为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

由图1可以得到原花青素标准曲线的回归方程为：y=1.7566x+0.0196，R2=0.9981，线性关系良好。

1.3.2 样品处理将待测样品离心后取上清液1.0mL置于试管中，加入6.0mL的4%香草醛-甲醇溶液和3.0mL浓盐酸，在室温下静置15min，在500nm的波长处测定吸光值。通过原花青素标准曲线的回归直线方程，可以计算出甘蔗叶片中原花青素的提取率。

提取率（%）=C×N×V/100M

式中：C为根据所测样品溶液中吸光度，代入标准曲线回归方程计算出的原花青素的溶液浓度，mg/m L；N为稀释倍数；V为所测样品体积，mL；M为所测样品的质量，g。

1.4 单因素试验

1.4.1 提取温度对甘蔗叶片中原花青素提取率的影响分别称取3.0g甘蔗叶片，粉碎，放置于锥形瓶中，按料液比为1∶20加入75%的乙醇溶液60mL，分别放入30、40、50、60、70℃的水浴中提取40min，每个温度梯度分别做3个对照试验，待测定后取平均值。分别对提取液进行离心、过滤，放入4℃冰箱中待用。

1.4.2 提取时间对甘蔗叶片中原花青素提取率的影响分别称取3.0g的甘蔗叶片，粉碎，分别置于锥形瓶中。按料液比为1∶20加入75%的乙醇溶液60mL，分别放入50℃的水浴中提取10min、20min、30min、40min、50min。每个时间梯度分别做3个对照试验，待测定后取平均值。得到提取液之后，对提取液进行离心、过滤。得到上层清液，放入4℃的冰箱之中冷藏保存。

1.4.3 提取料液比对甘蔗叶片中原花青素提取率的影响分别称取3.0g的甘蔗叶片，粉碎，分别置于锥形瓶中。分别按料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入75%的乙醇溶液。将锥形瓶放入50℃的水浴中提取40min。每个料液比梯度分别做3个对照试验，待测定后取平均值。得到提取液之后，对提取液进行离心、过滤。得到上层清液，放入4℃的冰箱之中冷藏保存。

1.4.4 乙醇浓度对甘蔗叶片中原花青素提取率的影响分别称取3.0g的甘蔗叶片，粉碎，分置于锥形瓶中。按照料液比1∶20分别加入30%、45%、60%、75%、90%的乙醇溶液，放入50℃的水浴中提取40min。每个乙醇浓度梯度分别做3个对照试验，待测定后取平均值。得到提取液之后，对提取液进行离心、过滤。得到上层清液，放入4℃的冰箱之中冷藏保存。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 水浴温度对原花青素提取率的影响如图2所示，原花青素的提取率在不同的温度条件下出现的结果不相同，在水浴温度40℃左右时，原花青素提取率出现最大值，高此温度逐渐下降。这可能和原花青素遇热不稳定有关。对原花青素的提取温度范围可以确定为30～50℃。

2.1.2 提取时间对原花青素提取率的影响见图2，随着时间的推移，原花青素的提取率也随之增加，这可能是浸提的时间越长，原花青素溶解于乙醇溶液的浓度越高有关，但当时间超过40min之后，随着时间的延长，原花青素的提取率反而降低。这可能和浸提时间过长，原花青素在溶液中分解有关。因而，原花青素的提取时间范围确定为30～50min。

图1 原花青素标准曲线Fig.1 The standard curve of procyanidin

图2 不同提取时间和温度对原花青素提取率的影响Fig.2 Effect of temperature and time on procyanidin extraction rate

2.1.3 不同料液比对原花青素提取率的影响在图3中可以看到在料液比为1∶15的时候，原花青素的提取率最高。随着乙醇溶液用量的增加，提取出来的原花青素的含量又出现下降。这就表明，在其他条件一致的情况下，可以选择料液比的范围为1∶10～1∶20。

2.1.4 不同乙醇浓度对原花青素提取率的影响

如图3所示，在乙醇浓度低于75%时，原花青素的提取率会随着乙醇浓度的增加而增加，但是当乙醇浓度超过75%的时候，原花青素的含量随着乙醇浓度的增加而下降。因而可以选择乙醇浓度在60%～90%。

2.2 正交试验结果

根据2．1的单因素试验结果，可以得到浸提时间范围是30～50min，水浴温度的范围是30～50℃，乙醇浓度的范围是60%～90%，料液比的范围是1∶10～1∶20。根据这几个范围设计的正交试验因素水平和试验结果如表1所示。

由表1可以看出，甘蔗叶片中含有一些原花青素成分，在提取时间为50min，提取温度为50℃，乙醇浓度为90%，料液比为1∶10的情况下，原花青素的提取率最高，达到1．103%。通过对极差的比较可知，对于影响原花青素提取率的几个因素中，可以看出影响原花青素提取率的因素影响程度为：乙醇浓度＞料液比＞浸提时间＞水浴温度，因而影响原花青素提取率最大的因素是乙醇浓度，影响最小的是水浴温度。

对正交试验结果进行分析可以看出，根据K值反应该因素水平对试验结果的影响程度，可以得出：A因素的K值在2条件下有最大值，B因素的K值在2条件下有最大值，C因素的K值在3因素条件下有最大值，同时，D因素在1条件下有最大值，因而对原花青素的提取率的最佳组合为A2B2C3D1，但是该组合不在表1中，因而要对表中的试验数据和得到的最佳组合进行联合分析，然后在这个基础之上完成对比试验，对比试验结果验证如表2所示。

根据表2的结果所示，发现正交试验得到的最佳提取条件组合大于正交设计表中出现的最大值，这就反应出，正交试验优化所得的最佳提取条件是原花青素的最佳提取条件。甘蔗叶中原花青素的最佳提取条件：40min浸出时间、水浴温度40℃，90%的乙醇浓度、固液比1∶10。在这种情况下，“滇蔗01－58”原花青素的萃取率是1．181%。

2.3 不同甘蔗栽培品种（系）和不同野生种原花青素提取率

根据2．2的结论，可以得出在提取时间40min，提取温度40℃，乙醇浓度为90%，料液比为1∶10，甘蔗叶片中的原花青素有最大提取率。因而根据这个条件对不同品种（系）的甘蔗叶片中原花青素进行提取，得到不同品种中原花青素的提取率如表3所示。

通过表3可以看出，10个不同栽培品种（系）的原花青素提取率的范围在0．0855%～1．354%之间，由高到低顺序为：滇蔗09－38＞新台糖22＞滇蔗02－7＞滇蔗04－14＞桂糖11＞滇蔗01－58＞新台糖10＞滇蔗01－106＞滇蔗11－138＞滇蔗11－485。其中滇蔗09－38的原花青素提取率最高，达到1．354%，而最低的是滇蔗11－485，原花青素提取率为0．855%。

表1 正交试验设计与原花青素提取结果Tab.1 The design and results of procyanidin extraction using orthogonal test

表2 原花青素提取最优工艺组合对比Tab.2 The comparison of optimal craft combination of procyanidin extraction

图3 不同料液比和乙醇浓度对原花青素提取率的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratio and ethanol concentration on procyanidin extraction rate

表3 不同甘蔗品种(系)叶片中原花青素提取率Tab.3 The procyanidin extraction rate on different sugarcane varieties

10个不同野生种原花青素的提取率为1．070%～1．372%，由高到低顺序为：割手密Ⅰ9－56＞蔗茅90－43＞割手密88－269＞割手密83－191＞五节芒Ⅰ91－27＞五节芒Ⅱ91－52＞美蔗茅IND81－001＞斑茅93－59＞斑茅Ⅱ91－125＞斑茅Ⅰ91－39，其中原花青素提取率最高的为割手密Ⅰ9－56，提取率为1．372%，最低的为斑茅Ⅰ91－39，提取率为1．070%。

通过分析可知，P值为0．055，对于所测定的20个栽培种和野生种甘蔗叶片中原花青素的含量而言，差异显著。通过表3中原花青素提取率的平均值可以看出，甘蔗野生种中原花青素提取率的平均值为1．2327%，高于甘蔗栽培品种（系）的原花青素的提取率的平均值1．0983%。在这20种不同的甘蔗叶片中，原花青素提取率最高的是割手密Ⅰ9－56（1．372%），最低的是滇蔗11－485（0．855%）。在10种不同类型的野生种中，割手密类原花青素提取率的平均值为1．334%，斑茅类原花青素提取率的平均值为1．094%，蔗茅类原花青素提取率的平均值为1．2625%，五节芒类原花青素提取率的平均值为1．2585%。可以看出，在不同类型的野生种的甘蔗叶片中，原花青素的提取率的大小为：割手密＞蔗茅＞五节芒＞斑茅。

3 小结

本试验对原花青素提取率的工艺研究中，选用的提取溶剂为乙醇，乙醇具有成本低廉，安全无毒，提取效率高等优点，且乙醇溶剂容易回收。在本试验中采用了正交试验，探讨了乙醇浓度、提取时间、提取温度和料液比几个因素对原花青素提取率的影响。通过优化得到最佳提取工艺：提取温度40℃、提取时间40min、乙醇浓度90%、料液比是1∶10，甘蔗品种“滇蔗01－58”原花青素的萃取率是1．181%，为提取甘蔗叶片中原花青素的含量提供了理论依据。在试验中，发现栽培种甘蔗叶片中原花青素的含量低于野生种的甘蔗叶片中的含量，差异表现出显著性，这可能和甘蔗的遗传以及对环境的适应性有关。对甘蔗叶片中原花青素含量的分析可以为甘蔗的综合开发利用提供理论基础。

[1]吴国芳，冯志坚，马炜良．植物学[M]．北京：北京：高等教育出版社，1992．

[2]刘凡值，刘文慈．甘蔗的多元化利用及其相关产业发展[J]．广西蔗糖，2009（4）：13－14，37．

[3]文明富，杨俊贤，潘方胤，等．甘蔗遗传改良研究进展[J]．广东农业科学，2016，43（6）：58－63．

[4]保国裕．从甘蔗中提制若干保健品的探讨[J]．甘蔗糖业，2003（2）：41－44．

[5]张慧文．花生红衣原花青素化学成分、衍生物和生物活性研究[D]．呼和浩特：内蒙古大学，2014．

[6]张妍，吴秀香．原花青素研究进展[J]．中药药理与临床，2011，27（6）：112－116．

[7]高峰，张琨，宋昕恬，等．葡萄籽提取物抗氧化作用人体实验研究[J]．中国卫生工程学，2010（2）：99－100．

[8]石云，唐瑛，王晓坤，等．原花青素对饮食所致高脂血症大鼠心血管的保护作用[J]．环境与职业医学，2008，25（1）：31－33．

[9]Tinsley JH，South S，Chiasson VL，et al．Interleukin－10 reduces inflammation，endothelial dysfunction and blood pressure in hypertensive pregnantrats[J]．Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2010,298（3）：R713－719．

[10]周振东．原花青素抗化疗损伤作用的实验研究[D]．宁波：宁波大学，2014．

[11]李小丽．葡萄籽原花青素治疗大鼠溃疡性结肠炎的作用机理研究[D]．兰州：兰州大学，2009．

[12]赵博欣．原花青素通过抑制P－糖蛋白功能与表达从而逆转肿瘤多药耐药作用的机制研究[D]．广州市：南方医科大学，2014．

[13]邹元生，徐瑞，温中平，等．沙棘籽原花青素提取物对小鼠免疫调节实验研究[J]．国际沙棘研究与开发，2012，10（1）：5－11．

Optimization of Assay and Extraction Technology of Procyanidin in Sugarcane Leaves

SHI Jing－yu,HE Li－lian,WANG Xian－hong,LIU Lu－feng,CHEN Shu－ying,LI Fu－sheng*
(College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,Yunnan)

Sugarcane variety Dianzhe 01－58 selected by Yunan Agricultural University was used as material,the craft conditions of procyanidine extraction was optimized and compared with procyanidine content of different sugarcane varietiy leaves．The results showed that the optimal extracting combination were temperature 40℃，ethanol concentration 90%(V/V),duration 40 min，and solid－liquid ratio 1:10,under above conditions,extraction rate was 1．181%．Different types sugarcane(cultivars and wild germplasms)of leaves contain different levels of procyanidin．Dianzhe 09－38 showed the highest levels of procyanidin in the sugarcane cultivars and"Saccharum spontaneum L．Ⅰ9－56"showed the highest levels of procyanidins in wild sugarcane germplasms,on the whole the procyanidin content of wild species were higher than that of cultivated species．

sugarcane;cultivar;wild species;leaves;procyanidin content;extraction rate

S566.101

A

1007－2624（2017）05－0005－04

10.13570/j.cnki.scc.2017.05.002

2017-05-10

云南省现代农业甘蔗产业技术体系建设项目；云南省创新团队项目（云科人发[2012]18号）；云南省教育厅科学研究基金重点项目（2015Z103）。

石景雨（1992-），女，安徽舒城人，云南农业大学在读硕士；研究方向：甘蔗资源研究与利用。

李富生（1968-），男，河南确山人，博士，教授，博导；研究方向：甘蔗资源研究与利用。E-mail：729709711@qq.com