引进红三叶种质资源遗传多样性的ISSR分析

柴继宽，赵桂琴，孟丽娟

（甘肃农业大学草业学院 草业生态系统教育部重点实验室 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070）

红三叶（Trifoliumpratense）是豆科蝶形花亚科三叶草属多年生草本植物，又名红车轴草、红花荷兰翘摇、金雀菜等［1］，寿命较长，一般可以生存5～8年，甚至10年以上［2］。红三叶草质柔软，叶量丰富，品质优良，营养价值高，各种家畜均喜食［3］。此外，红三叶也因含有大量的异黄酮等物质而颇受保健品和医药产品市场的青睐［4］。

我国红三叶种质资源比较匮乏，野生种仅见于新疆、贵州、云南等地［5］。上世纪70年代从美国、新西兰和欧洲引进了一批红三叶优良品种，目前在生产中使用的已经很少。我国在红三叶方面的研究主要侧重于栽培技术［6］，营养价值［7］，转基因［8］，异黄酮含量［9］以及高富硒能力［10］等方面。有关刈割时间、次数［11］对红三叶再生草生物学特性的影响以及施氮、磷肥和缓释复合肥［12］对红三叶营养元素含量、草产量和品质效应方面的报道也比较多。

到目前为止，通过全国草品种审定委员会等级的红三叶品种只有4个，且都是地方品种。生产中使用的红三叶品种主要来自国外。对引进品种的深入研究是进一步利用的基础。由于地域差异，引进种质有时会表现出优异的特性［13］，但受环境条件的影响比较大。同一基因型在不同环境条件下表现不同，而相同的表型又可能具有不同的基因型［14］。红三叶是异花授粉植物，单纯通过表型性状来研究其遗传关系以及进行种质筛选，可靠性比较低。在研究多样性时，不仅要分析形态特征如外观、叶型、株高、茎色、熟期等方面的差异，还需要分析其遗传背景。因此，应用现代分子生物学技术尤其是分子标记技术对红三叶的遗传多样性和亲缘关系进行研究显得尤为重要。

通过分子标记不仅可以了解到植物遗传背景信息，还可以深入研究其遗传多样性，可靠性比较高［15］。ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）分子标记技术是一种基于PCR的新兴DNA分子标记技术。与其他分子标记相比，ISSR分子标记具有很大的优越性，如试验操作简单、成本低、快速灵敏、稳定性高、所需DNA量少等［16-17］，而且不需要预先知道研究对象的基因组序列，大大减少了多态性分析的预备工作。近年来，ISSR分子标记在牧草种质资源的鉴定与评价中已经得到了广泛应用。在苜蓿（MedicagoSativa）［18］、羊茅（FestucaOvina）［19］、雀麦属（Bromus）［20］和鸭茅（Dactylis）［21-22］等种质资源遗传多样性研究方面均有报道。三叶草方面的研究主要集中于白三叶。Sharmas等［23］利用形态学和RAPD分子标记对引进白三叶品种遗传多样性进行了分析；George等［24］利用SSR标记检测了不同产地白三叶品种的遗传多样性。国内李润芳［25］等、张婧源［26］等利用SRAP技术对白三叶种质资源的遗传多样性进行了研究。红三叶方面，Dias等［27］利用形态学和SSR分子标记对来自35个国家的80份红三叶的遗传多样性进行了分析；Camposs等［28］利用RAPD分子标记对4组红三叶优异亲本材料遗传多样性进行了分析；Herrmann等［29］对红三叶AFLP反应体系进行了优化并对红三叶野生种和栽培种的遗传多样性做了分析；Paplauskiene等［30］利用ISSR-PCR分子标记研究红三叶品种的遗传变异。目前国内利用ISSR标记研究红三叶遗传多样性尚未见报道。

本研究拟利用ISSR分子标记技术，从DNA分子水平上分析31份国外引进红三叶种质间的亲缘关系和遗传多样性状况，旨在为红三叶种质资源的评价及合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为来自俄罗斯、加拿大和美国的31份红三叶种质材料（表1），均按10m2（2m×5m）的小区种植于甘肃省中部的榆中县良种场；于分枝期取样，每份材料随机取30个单株，从每个单株上采集基部刚展开的新叶2～3片，置于-80℃冰箱内保存。

1.2 基因组DNA的提取与检测

采用改良的CTAB法［31］提取红三叶叶片总DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量，并用Gene Spec核酸检测仪检测DNA质量浓度。最后将样品稀释为20ng·μL-1，-20℃保存备用。

表1 试验材料及来源Table 1 The materials and their source

1.3 ISSR引物筛选

基于ISSR 标记在苜蓿［18］、扁蓄豆（Pocockia ruthenia（L.）Boiss.）［32］、猪屎豆（Crotalariamucronata）［33］等豆科植物的研究报道。本研究ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供的100个ISSR引物序列，选出20个引物进一步筛选用于红三叶ISSR-PCR反应，由上海生物工程有限公司合成。

1.4 ISSR-PCR扩增及电泳检测

利用正交设计，从4个水平上对影响ISSRPCR反应体系的主要因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物）进行筛选与优化，建立了重复性好、反应稳定的红三叶ISSR-PCR反应体系。即25μL反应体系中，包含40ng模板DNA，10×PCR-buffer 2.5μL，2.5mmol·L-1Mg2+，2.5U Taq DNA聚合酶，引物1μmol·L-1，0.2mmol·L-1dNTP。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，引物退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸7min，4℃保存。

PCR扩增完成后，取8μL扩增产物在1.7%的琼脂糖凝胶上电泳，用DM2000作标准分子量对照，在1×TBE缓冲液中电泳约1h（电压为100 V），检测后置于UVP紫外凝胶成像系统中观察拍照。

1.5 数据分析

根据电泳图谱中清晰可辩的扩增条带在同一位置上的有无记数，有记为“1”，无记为“0”，统计PCR扩增产物的条带总数和多态性条带数。计算多态性位点比率P=i/j×100%，式中i为多态性位点数目，j为统计出的位点总数。用POPGEN1.32软件计算多态位点百分率（PPB）、Nei基因多样性指数（H）、有效等位基因数（Ne）和Shannon多样性信息指数（I）。用软件NTYSYS-PC 2.10e计算遗传相似系数（genetic similarity）GS=2Nij/（Ni+Nj），式中，Ni和Nj分别为i和j两材料的扩增条带数，Nij为i和j两材料共有的扩增条带数。根据GS值按非加权配对算术平均法（UPMGA）进行聚类分析，建立聚类图。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的质量检测

将提取的31个供试材料的基因组DNA的质量进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。31份红三叶种质的基因组DNA都呈现清晰、可辨谱带，无降解现象，无弥散的荧光出现，加样孔清晰，同时无RNA和其他非特异性DNA片段污染，因此保证了供试材料DNA进行ISSR分析的有效性和准确性。

图1 31个红三叶品系基因组DNA电泳图Fig.1 Electrophoresis of genetic DNA for 31red clover accessions

2.2 ISSR引物筛选及扩增条带的多态性

利用两个表型差异较大的材料对20个ISSR引物进行筛选，淘汰扩增效果差、带型不易辨认的引物，最终筛选出5个条带清晰、稳定性和重复性好且相对条带较多的引物（表2）。利用这5个引物对所有31份红三叶种质基因组DNA进行ISSR扩增，共扩增出61个DNA片段，其中多态性带58个，多态性比率高达95.08%。单条引物扩增出的清晰条带数在8～20条之间，平均每条引物扩增出11.6条多态性条带，其中引物850最多扩增出20条多态性条带；引物848最少能扩增出4条多态性条带。扩增出的DNA片段集中在150～2000bp之间。其中，多态性百分率最高的为引物849，850和851，均为100%；最低的为引物841，为75%。可见ISSR检测红三叶种质资源遗传多样性的效率很高，也表明红三叶种质在分子水平上的遗传多样性是比较丰富的。引物851对31份红三叶种质基因组DNA的扩增结果如图2所示。

表2 供试材料的ISSR引物及扩增结果Table 2 Primers used in ISSR and amplification results of tested materials

图2 UBC851对31份红三叶种质的ISSR扩增结果Fig.2 The amplification result of UBC851ISSR marker

2.3 遗传多样性分析

等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon多样性信息指数（I）和Nei’s基因多样性指数（H）都是衡量遗传多样性水平的常用指标。有效等位基因数（Ne）和Nei’s基因多样性指数（H）是目前应用较为广泛的遗传多样性指数，具有明显的遗传学意义。Shannon多样性信息指数（I）本身没有遗传学意义，但方便与同类研究进行比较［34］。通过 POPGENE1.32软件分析，结果表明，31份红三叶种质材料的平均Na，Ne，H和I值分别为1.9508，1.3162，0.2092 和0.3427（表3）。

表3 31份红三叶种质材料遗传多样性指数Table 3 Genetic diversity indexes of 31red clover germplasm

2.4 遗传相似性分析

遗传相似系数是用来比较群体或个体间相似程度的度量参数，遗传相似系数值越大，说明材料间相似程度越大，遗传背景一致性越强［35］。利用5个引物产生的标记信息，经POPGENE1.32分析软件计算31份红三叶种质间的遗传相似系数（GS），得到供试材料相似系数矩阵（表4）。遗传相似系数值越大，说明材料间的亲缘关系越近，反之，亲缘关系越远。由表4可知，31份红三叶种质的遗传相似系数在0.5902～0.9344之间，平均遗传相似系数为0.7840。从表4可以看出，1号和2号、5号和6号、17号和18号种质之间的遗传相似系数最大（0.9344），说明他们之间的亲缘关系最近，遗传差异相对较小；16号和31号之间的遗传相似系数最小（0.5902），说明二者的亲缘关系最远，遗传差异相对较大。

表4 ISSR标记的31份红三叶材料之间的遗传相似系数Table 4 Genetic similarity coefficient of 31red clover germplasm based on ISSR

2.5 聚类分析

为了确定各供试材料间的遗传关系，通过NTSYS-PC 2.10e软件，以31份红三叶种质材料和61个位点的谱带数为原始矩阵，利用非加权平均距离法（UPGMA）进行聚类分析，构建31个红三叶种质间的遗传关系聚类图（图3）。从图3可以看出，供试材料以遗传相似系数0.806为阈值可以将31份红三叶种质聚为5类。第Ⅰ类由来自俄罗斯的10份红三叶种质材料组成；第Ⅱ类包括11份种质材料，其中有来自俄罗斯的9份种质和加拿大的2份种质；第Ⅲ类由来自加拿大的2份红三叶种质组成；第Ⅳ类是来自加拿大的24号种质；第Ⅴ类包括7份种质材料，包括加拿大的2份种质和美国的5份种质。

3 讨论与结论

遗传多样性是生物所携带的遗传信息总和，是每种生物所固有的特性，也是其生存、发展和进化的基础［36］。一个种群遗传多样性越高或越丰富，在环境发生变化时生存下来的可能性就越大，越容易扩展其分布范围和开拓新环境，可见物种或种群进化潜力和适应环境的能力取决于遗传多样性的大小［37］。分子标记能从DNA水平上检测遗传变异，是进行物种遗传多样性、分类和亲缘关系分析等方面研究的有力工具。ISSR标记是一种基于PCR的分子标记，结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点，大多为显性标记，符合孟德尔遗传规律，多态性很高，而且引物具有通用性，可以在多种植物中通用［38-39］，是一种重复性好、效率高的分子标记，近年来在遗传多样性分析领域被广泛应用［40-41］。ISSR比RAPD能检测到更多的信息位点，更适用于红三叶的遗传多样性分析。本研究利用ISSR技术对31份红三叶种质的遗传多样性进行分析，从20条ISSR引物中筛选出5条多态性高、反应稳定的引物，共扩增出61条带，平均每条引物能扩增出12.2条带，其多态位点百分率（P）高达95.08%，Shannon信息指数（I）为0.3427，有效等位基因数（Ne）为1.3162，Nei’s基因多样性指数（H）为0.2092，都反映出红三叶种质很高的遗传多样性。

图3 31份红三叶种质基于ISSR的遗传相似性UPGMA聚类图Fig.3 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 31red clover germplasm

从相似系数看，31份红三叶种质的遗传相似系数分布在0.5902～0.9344之间，表明红三叶的遗传多样性是比较丰富的，这与Ulloa等［42］利用RAPD标记技术的研究结果相似。这种多态性将为红三叶种质资源异地保存、鉴定、适应性评价以及生态型研究奠定可靠、稳定的基因基础。基于ISSR标记，31份红三叶种质材料以遗传相似系数0.806为分类界限，可以聚为5大类。从聚类图上看，大多数来源地相同的红三叶种质资源聚在一起，如第Ⅰ类的材料全部来自加拿大，说明其亲缘关系较近；李红等［43］在研究苜蓿遗传多样性时也得到了相似的结论，即来自不同地区的种质，大部分可按地理来源聚为一类。但也存在部分同一来源地的种质间遗传相似系数差异较大无法聚为一类的情况，如来自加拿大的24号种质材料单独聚为一类。与其他种质材料的遗传距离较远，这与其独特的表型相符，24号种质材料具有叶片大、再生速度快、干草产量高等优异特性。

作者对31份红三叶种质的形态特征和农艺性状也进行了研究［44］，发现来自美国的材料叶片大、节间长、干草产量高、再生速度快、种子千粒重；俄罗斯的种质普遍分枝数多、叶片小、节间短、干草产量较低、种子也较小。根据形态特征的聚类结果把31个红三叶种质分成4类，表现优良的23号和24号种质聚为同一类。ISSR分子标记将31份红三叶种质在遗传相似系数0.806处聚为5类，24号种质材料单独聚为一类，与其他材料遗传距离较远。虽然两种聚类分析都可将大部分地理来源相近的种质聚在一起，但ISSR标记聚类的结果与基于形态特征聚类的结果仍然存在一些差别。这可能是由于ISSR标记体现的是种质材料间分子水平上的差异，而表型性状的差异是基因与环境共同作用的结果，因此，检测出的遗传差异并不都与所观测的表型差异相一致。作为传统分类的补充，ISSR分子标记可减少由形态描述和环境条件产生的误差，从分子水平鉴定种质资源之间的差异［45］，不受取材、时间及人为等因素的影响［46］，更容易把不同的种质材料区分开。因此，ISSR标记在一定程度上能更本质地反映出红三叶种质资源间亲缘关系的远近。在实际应用中可将ISSR分析结果直接应用于品种选育，选择遗传距离较大、亲缘关系较远的材料做亲本，以增加后代的遗传重组，提高杂种优势。