叶酸对老年冠心病患者外周血内皮祖细胞数量及功能的影响

陈杰民 涂 昌 程 飞 刘瑞杰 梁逸仙 夏文豪 兰 军 潘伟彪

(东莞市第三人民医院心内科，广东 东莞 523326)

叶酸对老年冠心病患者外周血内皮祖细胞数量及功能的影响

陈杰民 涂 昌 程 飞 刘瑞杰 梁逸仙 夏文豪1兰 军 潘伟彪

(东莞市第三人民医院心内科，广东 东莞 523326)

目的探讨老年冠心病患者口服叶酸治疗对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及功能的影响。方法选择初次诊断为冠心病的老年患者60例，随机分为治疗组和对照组，每组30例，在规范的冠心病二级预防基础上，治疗组给予叶酸5 mg/d口服，对照组口服安慰剂。在入院时、服药4 w及8 w时检测两组患者的同型半胱氨酸(Hcy)和血流介导的内皮舒张功能(FMD)水平，并利用外周血分离单个核细胞进行体外诱导培养，分别观察其集落形成、增殖及迁移能力。结果DiL-acLDL(红色)和FITC-UEA-1(绿色)染色双阳性的细胞可鉴定为EPCs。与对照组比较，治疗组治疗8 w EPCs数量、迁移及增殖能力显著增高〔(67.70±4.09)个vs(48.92±3.55)个，(34.03±3.43)%vs(27.54±4.24)%，(0.67±0.04)%vs(0.54±0.04)%，P<0.05〕，FMD水平显著增高〔(7.63±1.67)%vs(5.36±1.33)%，P<0.05〕，Hcy水平显著降低〔(10.37±0.84)μmol/L vs(12.23±0.74)μmol/L，P<0.05〕。EPCs数量、迁移、增殖能力与Hcy水平呈负相关(r=-0.668,P<0.05;r=-0.657,P<0.05;r=-0.775,P<0.05)，FMD水平与Hcy水平呈负相关(r=-0.718，P<0.05)。结论老年冠心病患者口服叶酸可增高外周血EPCs的数量、迁移及增殖能力，改善血流介导的FMD，这可能与叶酸降低Hcy水平有关。

冠心病；内皮祖细胞；同型半胱氨酸；叶酸

内皮祖细胞(EPCs)能够增殖并分化为成熟内皮细胞的前体细胞，参与微血管的新生、损伤血管的修复和内皮功能的维持，在抑制动脉粥样硬化的进程中发挥重要的作用〔1〕。EPCs数量及功能下降与多种因素有关，高同型半胱氨酸(Hcy)血症在当中发挥了重要作用，高Hcy血症可抑制EPCs的增殖、迁移和存活，延缓血管内皮的修复〔2〕。叶酸是Hcy代谢过程中的辅酶，其缺乏可引起血浆中Hcy升高，补充叶酸已被证实可有效降低老年患者血浆Hcy水平〔3〕，但是否对EPCs的数量以及功能产生影响，目前国内外的报道较少。本研究通过观察老年冠心病患者在口服叶酸前后外周血EPCs的数量及功能的变化，探讨补充叶酸对老年冠心病患者可能的获益。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2013年7月至2014年6在东莞市第三人民医院心内科收治的初次诊断为冠心病的老年患者60例，男36例，女24例，年龄60～75〔平均(67.37±3.95)〕岁，所有患者经冠状动脉造影或冠状动脉CT血管造影(CTA)检查，任何一支冠状动脉主要分支狭窄≥50%诊断为冠心病。随机将患者分为治疗组和对照组，每组30例。按规范的冠心病二级预防方案给予阿司匹林、β受体阻滞剂和他汀类药物。在此基础上，治疗组给予叶酸5 mg/d口服，对照组口服安慰剂。所有受试对象均排除肿瘤、感染、自身免疫性疾病、严重肝肾功能不全等疾病。此研究符合人体试验委员会制定的伦理标准，所有患者均同意加入研究并签署知情同意书。两组患者男性比例、高血压、糖尿病、吸烟史、年龄、空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

1.2方法

表1 两组人群基础指标比较

1.2.1基线数据检测 受试对象均详细询问病史，记录年龄和吸烟史，测量并记录血压，检测各项生化指标，常规检查胸部X线、心电图、心脏彩色超声和腹部B超，排除肿瘤等其他疾患。入院时、服药4、8 w时检测患者的Hcy和血流介导的内皮舒张功能(FMD)水平，并利用外周血分离单个核细胞进行体外诱导培养，分别观察其集落形成、增殖及迁移能力。

1.2.2FMD测定 患者取仰卧位，充分暴露左上臂，使用7.5 MHz的超声探头(飞利浦IE33超声心动图仪)进行检测。探头放置于左侧肘窝上方3～5 cm处，充分显示肱动脉的长轴二维图像，取得最佳直线动脉血液界面和最大肱动脉内径。首先测定基础的肱动脉内径，然后将血压计的袖带绑在左侧肘部，充气并加压至200 mmHg，加压4 min后迅速放气减压，放气60～90 s内再次测定肱动脉内径。FMD值以充血后反应性的肱动脉内径和基础的肱动脉内径之间变化的百分比表示。

1.2.3EPCs培养与鉴定 抽取患者的外周血20 ml，使用密度梯度离心法获得单个核细胞。将细胞贴壁培养7 d后，加入0.02 mg/ml的DiI-acLDL溶液(采购自美国Molecular Probe公司)，在37℃下孵育2 h；用磷酸盐缓冲液冲洗2次，然后加入4%多聚甲醛溶液固定细胞15 min，再使用磷酸盐缓冲液冲洗2次。完成上述步骤后，加入0.01 mg/ml的FITC-UEA-1溶液(采购自美国Sigma公司)，37℃下孵育1 h；加入10 μg/ml的二脒基苯基吲哚溶液，37℃下孵育5 min。最后，使用荧光倒置显微镜进行观察，DiI-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞为EPCs。EPCs培养第7天后，在40倍显微镜镜下随机选取3个视野进行细胞计数，取平均值。

1.2.4EPCs迁移能力检测 首先在改良Boyden小室下室加入含有50 ng/ml血管内皮生长因子的杜氏培养液，然后使用2.5 g/L的胰酶消化贴壁细胞，并将细胞悬浮于杜氏培养液中。将含1×105个悬浮细胞的杜氏培养液500 μl注入上室进行培养，培养24 h后去除滤膜上的未迁移细胞，然后使用甲醇进行固定，Giemsa 溶液进行染色，在400倍显微镜镜下随机选3个视野对迁移细胞进行计数，取平均值。

1.2.5EPCs增殖能力检测 EPCs培养7 d后，首先使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化贴壁细胞，并将细胞悬浮于杜氏培养液中，然后将细胞接种到使用人纤维连接蛋白包被的96孔培养板上，培养板上每孔加入10 μl噻唑蓝(5 g/L)。经过4 h的培养后，首先去除上清液，然后在培养板上每孔加入150 μl二甲基亚砜，充分摇匀，10 min后使用酶标仪下在波长490 nm处检测吸光度值。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行t检验，χ2检验，直线相关分析。

2 结 果

2.1EPCs鉴定 DiL-acLDL(红色)和FITC-UEA-1(绿色)染色双阳性细胞鉴定为EPCs。见图1。

2.2两组治疗后Hcy水平，EPCs数量、增殖、迁移能力以及FMD比较 与对照组比较，治疗组EPCs数量、迁移及增殖能力及FMD显著增高，Hcy水平显著降低(P<0.05)。见表2。

2.3EPCs数量、迁移、增殖能力与内皮舒张功能与Hcy水平的相关性 叶酸治疗8 w后，EPCs数量、迁移、增殖能力与Hcy水平呈负相关(r=-0.668,P<0.05;r=-0.657,P<0.05;r=-0.775,P<0.05)，FMD水平与Hcy水平呈负相关(r=-0.718，P<0.05)。

DiI-acLDL(红色)

FITC-UEA-1(绿色)

双染色阳性细胞

表2 两组治疗后Hcy水平和EPCs数量、增殖、迁移能力及FMD比较

与对照组同时点比较:1)P<0.05

3 讨 论

我们的前期研究发现，在冠心病患者中，EPCs数量明显降低，且患者的内皮功能与EPCs数量呈负相关〔4〕。EPCs数量及功能下降与多种因素有关，在中国老年患者中较为常见的高Hcy血症在当中发挥了重要作用。Veeranna等〔5〕发现，高Hcy血症可抑制EPCs的增殖、迁移和存活，延缓血管内皮的修复，与动脉粥样硬化相关；Huang等〔2〕的研究也发现冠心病患者的EPCs与Hcy水平相关。年龄是影响Hcy水平的一个重要因素，可能的原因包括老年人群的食欲普遍减退，消化系统功能较年轻时有所下降，导致叶酸等营养素摄入减少；同时，体内与Hcy代谢相关的酶活性下降，导致Hcy难以降解；此外，肾功能下降导致Hcy排泄减少亦可导致Hcy在体内的水平升高。目前已知补充叶酸是降低体内Hcy的安全和有效的方法。本研究可以证实，老年冠心病患者口服叶酸可改善外周血EPCs的数量及功能，与此同时患者的Hcy水平明显下降，由此可以推测，EPC的数量与功能改善可能与Hcy水平降低有关。

此外，叶酸对内皮功能的保护也可能与其他因素有关。我们的前期研究发现，叶酸可通过降低氧化应激改善冠心病患者的内皮功能，且这种作用并不依赖于Hcy的降低〔6〕。四氢生物蝶呤是内皮型一氧化氮合酶的必要的辅助因子，四氢生物蝶呤缺乏导致一氧化氮合酶脱耦联，氧化应激的激活可损害血管的内皮功能，同时促进动脉粥样硬化的发生发展。叶酸是四氧生物蝶呤系类似物，并有抗氧化的作用。外源性补充叶酸可以通过提高四氢生物蝶呤的水平、抗氧化应激等途径改善内皮功能，阻断动脉粥样硬化的发生发展，这种作用独立于其对Hcy水平的影响。

另外，也可能存在叶酸与冠心病二级预防药物的协同效应，调脂药物如他汀类药物〔7〕可导致EPC数量及活性增加。总之，内皮功能障碍的本质是内皮损伤和修复之间的动态平衡的破坏，EPCs在维持心血管系统稳定状态中起着重要作用。本研究结果显示，叶酸可以改善老年性冠心病患者外周血EPCs的数量及其活性，从而为临床补充叶酸改善血管内皮功能提供了一定的理论依据。本研究也存在不足，如缺乏远期临床预后的数据，研究结果的临床意义有待进一步明确。叶酸价格低廉，口服方便，无明显副作用，尤其适合老年患者。因此，补充叶酸对治疗老年冠心病无疑很有前景。

1Ali ZA，Rinza R，Douglas G，etal.Tetrahydrobiopterin determines vascular remodeling through enhanced endothelial cell survival and regeneration〔J〕.Circulation，2013；10：S50-8.

2Huang C，Zhang L，Pan H，etal.Endothelial progenitor cells are associated with homocysteine in coronary artery disease〔J〕.Acta Cardiol，2011；66(6)：773-7.

3Anderson CA，Jee SH，Charleston J，etal.Effects of folic acid supplementation on serum folate and plasma homocysteine concentrations in older adults：a dose-response trial〔J〕.Am J Epidemiol，2010；172(8)：932-41.

4涂 昌，兰 军，粱逸仙，等.药物洗脱支架对老年性急性冠状动脉综合征患者内皮祖细胞的影响〔J〕.中华老年心脑血管病杂志，2012；14(9)：918-20.

5Veeranna T，Zalawadiya SK，Niraj A，etal.Homocysteine and reclassification of cardiovascular disease risk〔J〕.J Am Coll Cardiol，2011；58(10)：1025-33.

6程 飞，潘伟彪，兰 军，等.口服叶酸辅助治疗冠心病的临床研究〔J〕.中国动脉硬化杂志，2014；22(5)：498-501.

7Bao XM，Wu CF，Lu GP，etal.Atorvastatin inhibits homocysteine-induced dysfunction and apoptosis in endothelial progenitor cells〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2010；31(4)：476-84.

〔2016-05-27修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

广东省医学科研基金(No.A2011722)；广东省科技厅社会引导发展项目(No.2011B031800011)

涂 昌(1973-)，男，硕士，主任医师，主要从事冠心病基础与临床研究。

陈杰民(1979-)，男，硕士，副主任医师，主要从事心血管疾病的介入诊疗研究。

R543.3

A

1005-9202(2017)17-4216-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.022

1 中山大学附属第一医院心内科