雷帕霉素抗神经胶质瘤的活性及其机制

宋和勇 马春兰 薛 婷 燕 楠

(青海省第五人民医院，青海 西宁 810001)

雷帕霉素抗神经胶质瘤的活性及其机制

宋和勇 马春兰 薛 婷 燕 楠

(青海省第五人民医院，青海 西宁 810001)

目的探讨雷帕霉素抗神经胶质瘤的肿瘤活性及其相关作用机制。方法MTT细胞毒实验检测雷帕霉素对神经胶质瘤细胞C6的生长抑制活性，Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡的发生，PI单染流式细胞仪检测细胞周期的变化，提取细胞总RNA，RT-PCR检测survivin mRNA的表达变化，提取细胞总蛋白Western印迹检测survivin蛋白的表达变化。结果雷帕霉素对神经胶质瘤细胞C6显示了高效的抗肿瘤活性，IC50值为(8.34±0.62)μmol/L。流式细胞仪凋亡分析显示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素作用C6细胞48 h后，细胞的凋亡率分别为(3.56%±1.04%)、(13.34%±3.86%)、(22.84%±4.53%)、(51.91%±6.29%)，各组间有统计学差异(P<0.01)。细胞周期分析显示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素处理C6细胞48h后，细胞增殖指数分别为(64.54%±6.04%)、(50.24%±4.86%)、(39.26%±5.61%)、(30.08%±6.42%)。RT-PCR和Western印迹检测显示雷帕霉素可以下调survivin mRNA和蛋白的表达。结论雷帕霉素具有高效的抗神经胶质瘤活性，其作用机制可能与其抑制了mTOR信号通路下调survivin靶蛋白的表达有关。

雷帕霉素；神经胶质瘤；mTOR信号通路；survivin

神经胶质瘤在脑肿瘤中占40%～60%，首选治疗方法是手术切除，但手术很难完全切除病灶，因此术后的化疗是延缓病变进展的重要措施，同时也是神经胶质瘤标准治疗方案的一个重要组成部分〔1〕。胶质瘤的预后很差，约有一半的患者在确诊后1年内死亡，约25%的患者会在确诊后的两年内死亡，神经胶质瘤高的死亡率及复发率使其成为预后最差的肿瘤〔2〕。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路对人体细胞生长、增殖及细胞周期调节有着重要的作用，相关研究表明其通路的激活与众多肿瘤的发生、发展密切相关〔3〕。雷帕霉素是mTOR蛋白的抑制剂，其在多种肿瘤中已显示出抑瘤活性〔4〕，近期的研究显示mTOR蛋白参与了神经胶质瘤的发生发展，并且与患者的预后也有一定的相关性〔5〕，本研究旨在探讨雷帕霉素致神经胶质瘤的凋亡活性及其相关作用机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 ①青霉素、链霉素、雷帕霉素及碘化丙啶(PI)由美国Sigma公司生产；②胎牛血清由杭州四季青生物工程材料有限公司生产；③ RPMI1640培养基由英韦创津公司生产；④ Annexin V/PI凋亡检测试剂盒由南京凯基生物科技有限公司生产；⑤ Trizol、RT-PCR试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司生产；⑥ survivin、GAPDH抗体及HRP标记的二抗由美国Santa Cruz公司生产。

1.2胶质瘤细胞系及培养方法 在温度为37℃及5% CO2条件下，将C6胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素高糖的DMEM培养液中。

1.3胶质瘤细胞生长抑制实验 将处于对数生长期的C6胶质瘤细胞接种到96孔板(3 000/孔)，待细胞贴壁后即可加入雷帕霉素(对倍稀释浓度)，在68 h后，加入MTT(0.5 mg/ml)，继续孵育4 h，然后弃其培养液，再加入DMSO溶解结晶，采用Model 550型酶标仪(Bio-Rad USA)570 nm波长处测定OD值，并计算药物半数抑制浓度(IC50值)及细胞生长抑制率。

1.4Annexin V/PI双染法细胞凋亡检测方法 将处于对数生长期的C6胶质瘤细胞接种到6孔板(0.5×106/孔)，待细胞贴壁后即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)处理C6细胞，48 h后，胰酶消化收集细胞且磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次(1 200 r/min离心5 min)，并按照试剂盒的要求加入PI及Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温并避光反应30 min，置冰上等待检测。采用Cytomics FC500流式细胞仪进行检测(Beckman Coulter，USA)，其中每个样品检测10 000个细胞，如Annexin V阳性和Annexin V与PI双阳性则为凋亡细胞，由此来计算细胞的凋亡率。

1.5PI单染细胞周期分析 将处于对数生长期的C6胶质瘤细胞接种到6孔板(0.5×106/孔)，待细胞贴壁即可后加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)处理C6细胞，48 h后，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，1 200 r/min离心5 min，75%的乙醇固定细胞4～6 h，PBS洗涤细胞2次，加入100 μg/ml碘化丙啶，室温染色15 min，流式细胞仪检测 (激发波长488 nm，吸收波长610 nm)收集10 000个细胞，细胞周期分析使用流式细胞仪自带ModFit LT 3.2 软件，增殖指数=〔(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) 〕×100%。

1.6RT-PCR检测 将本次研究处于对数生长期的C6胶质瘤细胞接种到6孔板(0.5×106/孔)，待细胞贴壁后即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)处理C6细胞，48 h后，去上清，PBS洗涤2次，加入Trizol(1 ml)，并依据Trizol说明书指导进行操作，提取细胞总的mRNA，同时依据反转录试剂盒说明书进行操作，反转出cDNA的第一链，PCR检测survinin基因的mRNA表达。Survivin上游引物:5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3′，下游引物：5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′；内参照GAPDH基因上游引物：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTT-3′，下游引物：5′-AATGCCAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。反应条件为：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环；72℃ 10 min。1.5%琼脂糖凝胶(100 V电压)电泳45 min后，凝胶成像仪观察并拍照分析。

1.7Western印迹分析 将处于对数生长期的C6胶质瘤细胞接种到6孔板(0.5×106/孔)，待细胞贴壁后加入即可加入雷帕霉素(0、5、10、20 μmol/L)处理C6细胞，48 h后，去上清并PBS洗涤2次，1×SDS上样缓冲液裂解细胞，95℃ 10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，在SDS-PAGE 胶(8%积层胶，12%分离胶)电压80 V电泳分离蛋白，然后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，再将PVDF膜浸润于TBST(含5%脱脂奶粉)中1 h，并加入survivin蛋白特异性一抗(1∶1 000)在温度4℃过夜，再次加入HRP标记的二抗(1∶5 000)室温下孵育1 h，再加入发光底物X-ray进行曝光显示目的蛋白条带，其中GAPDH蛋白作为内参照以显示相同的上样量。

1.8统计学方法 应用SPSS18.0软件行t检验、方差分析。

2 结 果

图1 雷帕霉素对胶质瘤C6细胞survivin表达的影响

2.1雷帕霉素对胶质瘤C6细胞的细胞毒作用 MTT细胞毒实验显示在50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78 μmol/L对倍稀释的雷帕霉素作用下，细胞的生长抑制率分别为(90.87%±7.85%)、(74.28%±5.02%)、(59.78%±4.75%)、(38.94%±5.64%)、(25.80%±4.21%)、(15.06%±2.84%)、(7.53%±3.62%)，由此计算的IC50值为(8.34±0.62)μmol/L。

2.2雷帕霉素对胶质瘤C6细胞的致凋亡作用 流式细胞仪凋亡分析显示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素处理C6细胞48 h后，细胞的凋亡率分别为(3.56%±1.04%)、(13.34%±3.86%)、(22.84%±4.53%)、(51.91%±6.29%)，雷帕霉素可以剂量依赖性的增加C6细胞的凋亡(P<0.01)。

2.3雷帕霉素对胶质瘤C6细胞细胞周期的影响 PI单染流式细胞仪细胞周期分析显示0、5、10、20 μmol/L雷帕霉素处理C6细胞48 h后，增殖指数分别为(64.54%±6.04%)、(50.24%±4.86%)、(39.26%±5.61%)、(30.08%±6.42%)，可见雷帕霉素剂量依赖性的抑制了C6细胞的增殖。

2.4雷帕霉素对胶质瘤C6细胞survivin表达的影响 雷帕霉素可以剂量依赖性地下调胶质瘤C6细胞survivin mRNA和蛋白的表达。见图1。

3 讨 论

肿瘤的发生与发展是一个原癌基因和抑癌基因参与的多基因、多因素、多步骤共同作用的结果〔6〕，其中多条信号转导通路出现调控异常，PI3K/Akt/mTOR信号通路是其中一条重要的致细胞增殖通路，而且最近的研究也发现，该通路可以调控肿瘤干细胞的增殖活性〔9,10〕。肿瘤干细胞是肿瘤内部的一小群起始细胞，是肿瘤产生耐药和经常复发的根源，可见靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路的治疗将会有广阔的临床应用前景〔9〕。雷帕霉素是临床广泛使用的一个免疫抑制剂，其可以抑制T和B淋巴细胞对白细胞介素(IL)-2的反应也可以抑制mTOR的活性调节细胞的生长。

P13K是一个由P85调节亚基和P110催化亚基组成的细胞内第二信使，上游的信号通路激活后磷酸化P85蛋白进而募集P110，催化膜内的PI2K生成PI3K，继而激活下游的mTOR蛋白，作为重要的一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR可以磷酸化其底物pS6K与4E-BP10YL，并促进蛋白质的翻译，其中包括一些抗凋亡蛋白〔10〕。本文的凋亡检测结果表明mTOR蛋白的抑制剂雷帕霉素能够剂量依赖性地增加神经胶质瘤C6细胞的凋亡比例。mTOR蛋白还可以调控细胞周期，阻止其G1期向S期的过度，本研究也显示了在雷帕霉素作用下C6细胞阻滞在G1期，细胞增殖指数呈剂量依赖性的减低。

survivin是凋亡蛋白抑制家族(IAP)的新成员，是IAP中迄今发现抗凋亡作用最强的因子，主要通过调节p21抑制caspase-3活化而发挥抗凋亡作用，其在肿瘤细胞内广泛表达，可见抑制survivin蛋白的表达将会有显著的致细胞凋亡作用〔11〕。最近的研究显示survivin的表达受到PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控，mTOR可以稳定survivin mRNA，结合其转录的起始区域上调蛋白的翻译〔12〕。本研究结果提示雷帕霉素可以剂量依赖性地下调survivin mRNA和蛋白的表达。

雷帕霉素具有高效的抗神经胶质瘤活性，抑制mTOR信号通路下调survivin靶蛋白的表达可能是其主要的作用机制。

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5He Y，Ju W，Hao H，etal.Dracorhodin perchlorate suppresses proliferation and induces apoptosis in human prostate cancer cell line PC-3〔J〕.Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011；31(2)：215-9.

6Rasul A，Ding C，Li X，etal.Dracorhodin perchlorate inhibits PI3K/Akt and NF-kappaB activation，up-regulates the expression of p53，and enhances apoptosis〔J〕.Apoptosis，2012；17(10)：1104-19.

7Gotter AL，Santarelli VP，Doran SM，etal.TASK-3 as a potential antidepressant target〔J〕.Brain Res，2011；1416：69-79.

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9Frodl T，O′Keane V.How does the brain deal with cumulative stress？ A review with focus on developmental stress，HPA axis function and hippocampal structure in humans〔J〕.Neurobiol Dis，2013；52(1)：24-37.

10Woo DH，Han KS，Shim JW，etal.TREK-1 and Best1 channels mediate fast and slow glutamate release in astrocytes upon GPCR activation〔J〕.Cell，2012；151(1)：25-40.

11Levant B.N-3(omega-3) polyunsaturated fatty acids in the pathophysiology and treatment of depression：pre-clinical evidence〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targets，2013；12(4)：450-9.

12Griebel G，Holsboer F.Neuropeptide receptor ligands as drugs for psychiatric diseases：The end of the beginning〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2012；11(6)：462-78.

〔2016-10-20修回〕

(编辑 李相军/滕欣航)

宋和勇(1973-)，男，副主任药师，主要从事临床药学研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4202-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.014