大黄酸对便秘小鼠肠道传输功能和结肠肌电及结肠黏膜水通道蛋白3表达的影响

姜洪波 孙莉莉 刘伯语 王昊阳 何瑞芳 张瑞玲 张玉姣 杜爱林

(新乡医学院第三附属医院营养科，河南 新乡 453003)

·基础研究·

大黄酸对便秘小鼠肠道传输功能和结肠肌电及结肠黏膜水通道蛋白3表达的影响

姜洪波 孙莉莉1刘伯语 王昊阳1何瑞芳1张瑞玲2张玉姣1杜爱林1

(新乡医学院第三附属医院营养科，河南 新乡 453003)

目的探讨大黄酸对便秘小鼠肠道传输功能、结肠肌电及结肠黏膜水通道蛋白(AQP)3表达的影响。方法90只小鼠随机分为对照组、便秘组和大黄酸组。用复方地芬诺脂片复制小鼠便秘模型后，大黄酸组用大黄酸灌胃治疗。测量3组首便时间，6 h排便数量，大便性状，小肠推进率，结肠肌电信号和结肠黏膜AQP3的表达。结果便秘组首粒排便时间较对照组显著延长(P<0.01)，6 h内排便粒数显著减少(P<0.01)，小肠推进率显著降低(P<0.01)；大黄酸组首次排便时间较便秘组显著缩短(P<0.01)，6 h内排便粒数显著增加(P<0.01)，小鼠小肠推进率显著提高(P<0.01)。3组结肠慢波近似于正弦波样曲线，便秘组结肠慢波较不规则。与对照组相比，便秘组结肠慢波频率显著减慢(P<0.05)。与便秘组相比，大黄酸组结肠慢波频率显著增快(P<0.05)。与对照组相比，便秘组结肠慢波频率变异系数显著增大(P<0.05)；与便秘组相比，大黄酸组结肠慢波频率变异系数显著降低(P<0.05)；与对照组相比，便秘组结肠慢波振幅显著降低(P<0.05)；与便秘组相比，大黄酸组结肠慢波振幅显著升高(P<0.05)。与对照组相比，便秘组结肠慢波振幅变异系数显著增大(P<0.05)；与便秘组相比，大黄酸组结肠慢波振幅变异系数显著减小(P<0.05)。便秘组结肠AQP3平均光密度值及阳性面积表达率明显高于对照组，大黄酸组结肠AQP3平均光密度值及阳性面积表达率明显低于便秘组(均P<0.05)。结论大黄酸能够有效地提高便秘小鼠的肠道传输功能，减少便秘小鼠结肠黏膜AQP3的表达，对缓解便秘具有显著疗效。

便秘；大黄酸；推进率；肌电；结肠；水通道蛋白3

便秘患者可并发痔疮、肛裂、直肠脱垂和结肠憩室〔1〕。此外，还易患荨麻疹、哮喘等过敏性疾病及胆结石症，头痛及肩凝症等多种疾病。此外，便秘患者的有害毒素长期持续刺激肠黏膜，肠道菌群失调，极大地增加了患大肠癌的风险，便秘尚可诱发乳腺癌。对于高血压、冠心病等心血管疾病患者，严重便秘可使血压急剧上升，造成脑卒中甚至猝死。不仅如此，慢性便秘还可诱发老年痴呆及心肌梗死等严重疾病。寻找安全有效、副作用小的药物很有价值意义。药用大黄具有泻热通便，清湿热的功能，用于实热便秘、积滞腹痛、泻痢黄疸等，临床应用广泛。大黄的主要成分之一大黄酸具有保肝、抗肝脏纤维化、防治糖尿病肾病(DN)、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫抑制、利尿等作用〔2，3〕。而传统医学认为大黄酸肠内菌转化产物大黄酸蒽酮具有泻下活性，能保护胃肠黏膜，清洁内环境，降脂减肥，延缓衰老等特点〔4〕。本文探讨大黄酸对便秘小鼠肠道传输功能、结肠肌电及结肠黏膜水通道蛋白3(AQP3)表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 复方地芬诺酯片为江苏平光制药有限责任公司产品(批号：0805221，2.5 g/片)，大黄酸为北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司产品，曙红Y为上海永叶生物科技有限公司(CAS号：17372-87-1)，一抗兔抗鼠单抗AQP3(北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司提供)，兔免疫组化检测试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术责任有限公司提供)，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L，pH7.2～7.4)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒ZLI-9018(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K1352222E)。BL-420F生物机能实验系统，石蜡切片机，光学显微镜(Nikon Eclipse E200)。

1.2动物及分组 取小鼠30只，新乡医学院动物中心提供，雌雄兼用，体重22～30 g。适应性喂养1 w后随机分成对照组、便秘组、大黄酸组，每组各10只。

1.3药剂的配制 取复方地芬诺酯片2片加入蒸馏水5 ml配制成混悬液，用量0.1 ml/10 g。准确称量大黄酸50 mg，加入蒸馏水10 ml，混合均匀，对大黄酸组小鼠灌胃治疗，用量0.1 ml/10 g。取曙红2 g加入蒸馏水10 ml配成混悬液。

1.4建模 建模前24 h禁食给水，按10 mg/kg复方地芬诺酯混悬液分别对便秘组和大黄酸组小鼠进行灌胃复制便秘模型。对照组用蒸馏水灌胃。每天观察记录粪便的形态、小鼠的体重及小鼠的毛发变化，并根据小鼠的粪便及体重变化情况适当增减给药剂量。确定便秘模型复制成功，大黄酸组小鼠灌胃大黄酸1 w，实验前均禁食不禁水14 h。便秘组和大黄酸组分别灌胃给予复方地芬诺酯片(10 mg/kg体重)和大黄酸(0.1 ml/10 g)，对照组用蒸馏水代替，0.5 h后，各组均给予曙红0.1 ml/10 g后，记录小鼠首粒红便的时间，粪便的性状，6 h大便粒数。

1.5小肠推进率的测定 大黄酸组小鼠灌胃大黄酸1 w后，各组均10只，均禁食不禁水14 h。便秘组和大黄酸组分别灌胃给予复方地芬诺酯片(10 mg/kg体重)和大黄酸(0.1 ml/10 g)，对照组用蒸馏水代替，0.5 h后，各组均给予曙红0.1 ml/10 g，曙红灌胃25 min后，将30只小鼠立即脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于玻璃板上，轻轻将小肠拉成直线，为小肠总长度，从幽门至曙红前沿为曙红推进长度。按下式计算曙红推进率：曙红推进率=曙红推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100%。

1.6大黄酸对便秘小鼠结肠肌电活动的测定 建模方法同1.4，测定三组小鼠的结肠肌电。各组小鼠禁食不禁水24 h，用20%乌拉坦腹腔注射麻醉(0.3 ml/只)，仰卧在手术台上，消毒后，沿下腹正中做约1.5 cm的纵行切口，显露回盲部，在结肠近段(距盲肠约1 cm)肌浆层内插入一对铜丝电极，两电极相距0.5 cm，铜丝与结肠和导线接触处去除绝缘层，铜丝两端与BL-420F生物机能实验系统的导线相连。灵敏度选择：增益放大倍数2 mV，时间常数0.001 s，高频滤波为20 Hz。慢波趋于稳定后开始记录，连续记录45 min，重复记录3次。

1.7结肠肌电活动参数分析 各组的记录结果均用3 min作为一个时间段的频率和振幅的均值、标准差及变异系数进行比较〔5〕。慢波频率变异系数(%)=慢波频率标准差/慢波频率均值×100%；慢波振幅变异系数(%)=慢波振幅标准差/慢波振幅均值×100%。

1.8免疫组化法检测小鼠结肠AQP3 建模方法同1.4。建模完成后，各组小鼠均禁食不禁水24 h，20%乌拉坦腹腔注射麻醉(0.3 ml/只)后，取小鼠近段结肠，用4%的多聚甲醛溶液进行固定，脱水，石蜡包埋，切片，切片厚度为7 μm。常规脱蜡，复水，免疫组织化学技术染色，二抗浓度为1∶200，中性树胶封片，晾干。在400倍光镜下观察AQP3的表达情况，以有明显棕褐色颗粒的细胞为阳性细胞，选择5个完整不重叠视野，用Image pro-Plus6.0软件统计分析每个视野的平均光密度值和阳性面积表达率。

1.9统计学处理 采用t检验。

2 结 果

2.1各组小鼠排便情况比较 对照组及大黄酸组较便秘组小鼠的粪便湿润、粒长、柔软，便秘组小鼠大便性状干结、质硬、粒短。大黄酸组小鼠6 h内排便的粒数较便秘组明显增多(P<0.01)，首粒红便排出的时间较便秘组明显缩短(P<0.01)。见表1。

表1 各组小鼠排便情况比较

与便秘组比较：1)P<0.01,下表同

2.2各组小鼠小肠推进率比较 大黄酸组小鼠小肠推进率较便秘组小鼠小肠推进率明显增大，大黄酸对便秘小鼠小肠推进功能有显著促进作用(P<0.01)，见表2。

表2 各组小肠推进率比较

2.3各组小鼠结肠肌电变化比较 各组小鼠的结肠慢波曲线近似为正弦波。与对照组比较，便秘组小鼠的结肠慢波频率显著减慢(P<0.05)；与便秘组比较，大黄酸组小鼠的结肠慢波频率明显增快(P<0.05)。与对照组相比，便秘组小鼠的结肠慢波频率变异系数明显增大(P<0.05)，与便秘组比较，大黄酸组小鼠的结肠慢波频率变异系数明显降低(P<0.05)。与对照组比较，便秘组小鼠的结肠慢波振幅显著减少(P<0.05)；与便秘组比较，大黄酸组小鼠的结肠慢波振幅显著升高(P<0.05)。与对照组比较，便秘组小鼠的结肠慢波振幅变异系数显著增大(P<0.05)；大黄酸组小鼠的结肠慢振幅率变异系数与便秘组相比，大黄酸组小鼠的结肠慢波振幅变异系数明显减小(P<0.05)，见表3及图1。

表3 各组结肠慢波频率、频率变异系数及振幅、振幅变异系数比较

与便秘组比较:1)P<0.01,2)P<0.05

图1 各组结肠肌电图

2.4结肠黏膜AQP3表达情况 上皮细胞AQP3阳性表达为棕褐色颗粒，结肠黏膜AQP3主要分布在上皮细胞基底部的细胞质和细胞顶部。正常组AQP3主要表达于吸收细胞，杯状细胞表达较少。便秘组吸收细胞和杯状细胞几乎都有AQP3表达，染色较深。大黄酸组与便秘组相比AQP3表达主要以吸收细胞为主，表达较少。便秘组AQP3的平均光密度值明显高于对照组〔(47.86±2.01) vs (33.24±2.75)，P<0.01〕，大黄酸组平均光密度值明显低于便秘组〔(40.15±3.10)，P<0.01〕，便秘组小鼠结肠AQP3的阳性面积表达率明显高于对照组〔(33.13±1.95)% vs (22.77±1.95)%,P<0.05〕，大黄酸组结肠AQP3的阳性面积表达率明显低于便秘组〔(27.83±1.86)%,P<0.05〕，见图2。

图2 各组结肠上皮细胞AQP3的免疫组化表达(DAB，×400)

3 讨 论

便秘是一种临床常见的复杂症状，主要表现为便意少，便次也少；排便艰难、费力；排便不畅；大便干结、硬便，排便不净感；便秘伴有腹痛或腹部不适。部分患者还伴有失眠、烦躁、多梦、抑郁、焦虑等精神心理障碍。其病因复杂，分为器质性和功能性。特别是现在因生活习惯的改变，工作性质和时间变化，饮食不规律，精神因素等多种原因的影响，便秘的发生率逐年上升，并且年龄愈来愈小，发生率随年龄的增加而增加。便秘的“报警”征象包括便血、贫血、消瘦、发热、黑便、腹痛等和肿瘤家族史。干结的大便蓄积在肠道会损伤肠黏膜而致便血、肛裂和痔疮。由于排便不畅，毒素蓄积，还会引起腹痛、腹胀、便不净感、消化不良，头晕、头痛、全身乏力等一系列症状。另外，便秘增加患癌症的风险，心血管疾病，糖尿病，免疫力下降，皮肤病，早衰，风湿，寄生虫污染，女性经期不顺，痛经等。

大黄酸是大黄发挥泻下作用的主要活性物质之一，在大黄游离蒽醌中占的比例较大且较稳定。大黄酸肠内菌转化产物大黄酸蒽酮有泻下活性，能够降低结肠对钠和氯离子的吸收，增加钾离子分泌。目前国内已有单体大黄酸作为一类新药已被国家科技部列为“十五”国家重大科技专项，现阶段大黄酸已成为国内外研究的热点，是配制保健品的最佳原料，可用于降脂减肥，清洁内环境，预防胃癌，保护胃黏膜，延缓衰老等方面，涉及的领域逐渐广泛。本文结果说明大黄酸对便秘小鼠有润便通便的作用，增强肠道传输的功能。

慢波电位又称基本电节律，是消化道平滑肌特有的电变化，是细胞自发性节律性去极化形成的。慢波是局部电位，起源于纵行肌，它虽然不能直接引起平滑肌收缩，但动作电位只能在慢波电位的基础上产生，因此慢波是平滑肌的起步电位，控制平滑肌收缩的节律。慢波是静息电位基础上产生的缓慢的节律性去极化波；它的产生可能与细胞膜生电钠泵的周期活动有关；结肠肌电动作电位产生于慢波之上，与平滑肌收缩一致，是结肠推进性运动的主要动力，慢波是相对规律的一种周期性电活动，无论收缩与否始终存在〔6〕，可间接反映结肠动力状况。因此，结肠慢波的频率和振幅可以作为反映结肠功能的一项客观电生理指标。变异系数反映同组内不同时间段频率和振幅的差异，用于衡量结肠活动节律的稳定性〔7〕。本文结果提示便秘组小鼠的慢波频率减慢及振幅降低，可能导致动作电位不易发生，从而使消化道平滑肌收缩减弱，致使肠道传输功能降低，导致粪便在肠内蓄积不易排出，引起便秘；大黄酸可能通过提高结肠肌电频率和振幅使动作电位易于产生，加快平滑肌收缩的节律，使肠道蠕动增加、传输功能提高，增加排便动力，加快粪便在结肠的排出速度。大黄酸组小鼠结肠传输功能的增强可能与大黄酸肠内菌转化产物大黄酸蒽酮的降低结肠对钠和氯离子的吸收，增加钾离子分泌的作用有关，而结肠细胞膜生电钠泵的周期活动的改变可能通过结肠慢波频率和振幅的改变来表现。大黄酸作用于便秘小鼠使便秘小鼠的慢波频率变异系数及慢波振幅变异系数均降低，说明结肠电生理活动稳定性增加，提示大黄酸有效地改善了便秘小鼠的结肠动力异常，稳定结肠慢波节律。大黄酸在短期内能有效缓解便秘，但长期应用是否会因大黄酸长久持续地增加结肠收缩波的数目而导致肠道收缩节律紊乱，还需进一步实验研究。

AQP3是水通道蛋白家族中的一个亚型，位于人类染色体9p13，其基因有4个外显子和3个内含子。AQP3组成为292个氨基酸，分子量为31 544 D。它可以转运水分子和溶质〔8〕。AQP3在结肠表达最高，主要位于近端结肠吸收上皮细胞的基底部和顶部〔9〕，其主要功能是将肠腔内的水和溶质从基底侧转移到细胞间隙中，减少结肠内的水分。因此，结肠黏膜AQP3表达的强度与粪便的性状密切相关。本文结果提示大黄酸治疗便秘的机制之一是通过下调结肠黏膜AQP3的表达，增加肠道水分，软化大便，润滑肠道内容物，减少排便阻力，从而使大便易于排出，起到缓解便秘的作用。

蒽醌类物质具有泻下作用，大黄酸属蒽醌类物质，但大黄酸对治疗便秘的作用机制尚未完全清楚。血管活性肠肽(VIP)是消化系统中主要的抑制性递质，存在于中枢神经和肠神经系统中，在肠道中十二指肠和结肠含量最高〔10〕，VIP对结肠水和电解质的分泌有很强的促进作用，对消化道平滑肌的收缩产生抑制作用。AQP3是VIP作用的靶分子之一。有研究表明VIP可以通过细胞蛋白激酶A 系统改变膜上水通道蛋白的含量来调节膜对水的通透性〔11〕。在便秘模型鼠小肠和结肠VIP含量均减少〔12〕，推测便秘的形成可能与肠神经系统中VIP能神经病理改变或功能障碍调节VIP含量和AQP3的表达有关。这些变化可能使肠道的节段性蠕动增加，而有效的推进性蠕动减少，导致便秘。便秘小鼠结肠功能的减弱可能经慢波频率和振幅的变化而来表现。有研究指出，大黄可使大鼠胃动素(MTL)和P物质(SP)含量升高，VIP含量降低〔13〕。推测大黄可能通过大黄酸作用于MTL、SP、VIP而使胃肠激素分泌增多、结肠推进功能增强，而结肠推进功能的增强可能通过结肠慢波频率和振幅的变化来表现。本实验中大黄酸组结肠黏膜AQP3表达减少，推测大黄酸可能调节VIP的含量，下调结肠黏膜AQP3的表达。上皮细胞顶质膜分布有钠通道，基底膜有Na+-K+-ATP酶，推测大黄酸可能通过调节钠通道蛋白和Na+-K+-ATP酶，Na+-K+-ATP酶将上皮细胞内的钠主动转运到上皮细胞间质速度降低，细胞内钠浓度降低速度减慢，使肠腔内水和钠分别通过顶质膜上AQP3和钠通道蛋白进入上皮细胞减少，从而使基底膜上水通道蛋白和Na+-K+-ATP酶经间质内毛细血管重吸收回体内的水的量减少，肠腔内水分增加，起到软化大便，增加肠内容物，增加肠道蠕动，减少排便阻力的作用，从而缓解小鼠便秘。但大黄酸对其他水通道蛋白亚族及胃肠激素的影响有待进一步实验研究。

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〔2015-12-15修回〕

(编辑 曹梦园)

EffectsofRheinontheintestinaltransmissionfunctionandaquaporin-3inmice

JIANGHong-Bo,SUNLi-Li,LIUBo-Yu,etal.

TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang453003,Henan，China

ObjectiveTo study Rhein on the intestinal transmission function and the effect of the expression of aquaporin(AQP)3 in the colonic mucosa of mice with constipation.Methods30 male mice were randomly divided into control, constipation and Rhein groups. Bowel transit function was measured by eosin propulsion test and recorded the first defecation time, the number of red stool in the initiative 6 hours and promoting rate of eosin. Immunohistochemistry was used to detect the expression of AQP3 in colon mucosa.ResultsThe grain number of red stool in 6 hours of constipation group was lessen than that of control group, associated with prolong of the first defecation time(P<0.01). Compared with constipation group, the first defecation time were shortened and the grain number of the defecation red stool in 6 hours of the mice increased(P<0.01),and promoting rate of mice small intestine were markedly increased in control group and Rhein group(P<0.01). There were significant differences in colonic myoelectricity of mice slow-waves frequency, slow-waves frequency variation coefficient, colonic myoelectricity of mice slow-waves amplitude, slow-waves amplitude variation coefficient, the expression of the mean optic density of AQP3 in colonic mucosa between constipation and control groups, constipation and Rhein groups(P<0.05).ConclusionsRhein could improve motor function in mice colon, reduce expression of AQP3 in colon mucosa, and has significant effects on the treatment of constipation.

Constipation; Rhein; Promoting rate; Myoelectricity; Colon; Aquaporin-3

国家自然科学基金(31600935)；国家级大学生创新创业训练计划(20160472013)；河南省教育厅课题(15A310006)；河南省卫生科技创新型人才工程专项经费(3052)；河南省高校科技创新团队(17IRTSTHN023)

张玉姣(1986-)，女，讲师，博士，硕士生导师，主要从事神经损伤与认知研究。 杜爱林(1972-)，男，副教授，硕士，主要从事神经损伤与营养研究。

姜洪波(1980-)，女，主治临床营养师，主治医师，讲师，硕士，主要从事神经损伤与营养研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)17-4169-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.001

1 新乡医学院生理学与神经生物学教研室 中英脑功能损伤联合实验室 河南省高校脑研究重点实验室培育基地

2 新乡医学院第二附属医院 河南省生物精神病学重点实验室