盐胁迫下苜蓿种质资源萌发特性综合评价

陈小芳， 于德花， 宁 凯， 徐化凌， 毕云霞

(东营市农业科学研究院， 山东 东营 257091)

我国是世界盐碱地大国之一，约有667万hm2盐碱地[1]，过度的开发利用致使次生盐碱地面积还在不断扩张[2-4]，土壤盐渍化问题是我国乃至世界农业生产都面临的困境，同时也对生态环境和社会经济造成严重危害。改良盐渍土过程复杂、难度大、耗时长，种植耐盐牧草是最为有效、经济的改良措施。苜蓿(Medicagosativa. L)叶片具有排盐机制[5]，耐盐能力较强，利用品种间的耐盐性差异培育耐盐良种，可在改良盐碱地的同时，提供优质蛋白质饲料，为盐碱地农牧业发展拓宽道路。

植物的耐盐性与其遗传因素及个体的发育阶段有关，种子能够在盐胁迫下萌发成苗，是植株在盐碱地成功定植的基础[6-8]。苜蓿耐盐机制发挥调节作用由特定的基因型决定，而且调节机制会随分化水平的变化而变化[9]。盐碱地中生长的苜蓿，各生长发育阶段都会受到盐胁迫的影响，其中对盐胁迫最敏感的时期为种子萌发期，由于地表土壤和地下土壤的盐度相差大约2～10倍，因而苜蓿种子萌发期面临的盐胁迫远大于其他生长发育阶段，苜蓿种子发芽期耐盐性评价对耐盐性苜蓿材料的选择和培育至关重要[10]，这与Al-khatib等[11]、刘卓和徐安凯[12]部分研究结论一致。本试验以23份苜蓿种质为材料，研究其种子在不同盐浓度胁迫下的萌发特性，通过对各项指标与耐盐性的相关性分析，筛选出苜蓿耐盐能力鉴定简洁有效的指标，为今后的耐盐性评价及耐盐苜蓿品种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2016年7月-2016年11月进行，共23份苜蓿种质，分别来源于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、山东农业工程学院、斯洛文尼亚农业研究所，种子名录及来源如表1所示。

表1 苜蓿种质名录及来源Table 1 List of alfalfa germplasms and origins

1.2 试验方法

根据《牧草种子检验规程》[13]选取成熟、大小一致、健康种子为试验材料，选用化学纯NaCl配制0.20%，0.40%，0.60%，0.80%，1.00%，1.20%和1.40%质量分数的盐溶液(蒸馏水为对照)，每梯度设置3个重复。供试种子用0.50%的次氯酸钠表面消毒5 min，蒸馏水冲洗干净，在直径100 mm的培养皿中均匀摆放100粒种子，加入4.5 mL NaCl溶液，用封口膜封好，置于25℃恒温培养箱内暗培养。

1.3 测定指标及方法

发芽势从第4 d开始统计，以后每隔一天统计一次，第8 d最后一次统计；发芽率在培养第10 d统计；处理12 d后，测定根长和苗高，每个重复随机选取10株苗。按照下列方法计算各项指标：

发芽指数(GI)=ΣGt/Dt(Gt表示处理后t日的发芽数，Dt表示相应的发芽日数)；

活力指数(VI)=GI×S(GI为发芽指数，S为平均根长)；

1.4 数据处理与分析

1)隶属函数分析：

对于不同的测定指标来说，有的指标变化的最大值与最小值之间差异非常大，因而该指标的绝对值在参与整个评价过程中所占的比重就比较大，对评价结果影响也就比较大[14]；而有的指标品种间差异比较小，则该指标的绝对值在综合评价过程中的贡献就可能比较小。这样就可能错误扩大或缩小某一个性状与品种品质的相关性。根据隶属函数的方法，对各品种各个指标求其隶属值并累加，综合比较各个品种，可消除因绝对值大小不同而可能造成的对正确评价材料优劣所作的贡献的不同[15]。

(1)

(2)

Yij为i品种的j指标的隶属函数值，Xij为i品种的j指标的均值，Xjmax为各品种j指标均值的最大值，Xjmin为各品种j指标均值的最小值。若j指标与耐盐性成正相关，则用公式(1)；若j指标与耐盐性成负相关，则用公式(2)[16]。

2)采用Excel 2003软件进行数据处理，用DPS V6.55统计分析软件进行方差分析、聚类分析和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 种苗耐盐性测定

2.1.1盐胁迫对种子发芽势、发芽率的影响 发芽势表征种子萌发初期的发芽力。方差分析表明(表2)，在相同NaCl盐浓度下各苜蓿种质的发芽势均呈极显著差异(P<0.01)。23个苜蓿种子发芽势大体上随着盐浓度的增加而降低，说明胁迫作用越强种子的发芽能力越弱。0.20%，0.40%，0.60%盐浓度下，分别有11、13、11份种质的种子发芽势高于对照，当盐浓度达到0.80%和1.00%时，只有9份和5份种质的种子发芽势高于对照，其他的都降低。随着NaCl盐浓度进一步增加，到1.20%时除‘4030’略微高于对照外，所有苜蓿种质种子发芽势均明显低于对照，‘游客’降幅最大，达85.41%。

表2 不同浓度NaCl胁迫对苜蓿种子发芽势的影响Table 2 Effects of different NaCl concentration on the germination potential of alfalfa germplasms

续表2

注：同列不同小写字母表示各品种间差异显著(P<0.05)；*表示在0.05水平上差异显著：**表示在0.01水平上差异极显著，下同

Note: Different lower case letters within the same column indicate significant difference at the 0.05 level. * and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 level, respectively. The same as below

相同NaCl浓度下，不同种质间发芽率差异达极显著水平(P<0.01)(表3)。0.20%，0.40%和0.60%盐浓度下，分别有9份、13份和13份种质的种子发芽率高于对照，当盐浓度达到0.80%时，只有7份种质的种子发芽势高于对照。随着NaCl盐浓度进一步增加，到1.00%时所有苜蓿种质的种子发芽势均明显低于对照，‘游客’降幅最大，达41.59%，说明1.00%盐浓度极大的限制了苜蓿种子的萌发。

表3 不同浓度NaCl胁迫对苜蓿种子发芽率的影响Table 3 Effects of different NaCl concentration on the germination rate of alfalfa germplasms

续表3

2.1.2盐胁迫对苜蓿根长的影响 研究胁迫环境对种子萌发的影响时，多以根的生长作为指标之一[17]。方差分析表明，在相同NaCl盐浓度下各种质的根长差异极显著(P<0.01)。与发芽率相比，随着NaCl浓度的升高，只有部分种质幼根伸长受到抑制(表4)。NaCl盐浓度为0.40%，0.60%，0.80%和1.00%时，所有试验材料根长均大于对照，0.60%时根长达到最大，说明低盐溶液一定程度上促进幼根生长。随着NaCl浓度的增加，促进作用逐渐减弱，当NaCl浓度为1.20%时，有13份种质幼根均低于对照，随着NaCl盐浓度进一步增加，到1.40%时,除‘中苜3号’和‘巨能2’外，所有苜蓿种质根长均明显低于对照，‘金皇后’降幅最大，达65.92%，说明‘中苜3号’和‘巨能2’耐盐性更强。

表4 不同浓度NaCl胁迫对苜蓿根长的影响Table 4 Effects of different NaCl concentration on the radicle growth of alfalfa

续表4

2.1.3盐胁迫对苜蓿苗高的影响 方差分析表明，相同NaCl浓度下不同种质间苗高呈极显著差异(P<0.01)。NaCl盐浓度0.20%，0.40%，0.60%时，部分种质苗高大于对照，其中0. 40%NaCl处理下12个品种(系)苗高大于对照，‘WL-SALT’比对照增加19.15%，其次为‘中苜3号’和‘游客’，分别增加12.97%和11.73%，其余9个品种(系)增加率都在10%以下，说明低浓度盐分对苜蓿苗高的促进作用有限；随着NaCl盐浓度的升高，0.80%及以上盐浓度处理下，幼苗苗高显著低于对照。均值比较表明，除0.40%NaCl盐浓度下苜蓿种质的平均苗高略高于(比对照高1.27%)对照外，整体呈现下降的趋势，1.40%NaCl盐浓度下苜蓿种质的平均苗高仅为对照的一半，高盐浓度极大地抑制了幼苗的生长。幼苗生长高的苜蓿耐盐性较强，排名前5位的分别是‘巨能2’、‘中苜1号’、‘L3003’、‘KRIMA’和‘耐盐之星’。

表5 不同浓度NaCl胁迫对苜蓿苗高的影响Table 5 Effects of different NaCl concentration on the seedling height of alfalfa

续表5

2.1.4苜蓿耐盐系数比较及聚类分析 不同苜蓿种质发芽率、苗高、根长和发芽指数耐盐系数差异明显，均达极显著水平(P<0.01)，根长的变化幅度最大为1.30～0.76(表6)。指标的耐盐系数大则说明品种(系)的耐盐性强，发芽率、发芽指数、根长、苗高耐盐系数最高的分别是‘4030’，‘巨能2’、‘中苜5号’和‘WL-SALT’，最低的是‘L3003’、‘游客’、‘WL414’和‘SOCA’。

表6 NaCl胁迫下苜蓿发芽率、苗高、根长、发芽指数耐盐系数差异Table 6 Differences of salt tolerance coefficient of seed germination rate, seedling height, root length，andgermination index of different alfalfa under NaCl stress

对发芽率、发芽指数、根长、苗高的耐盐系数进行标准化处理，以欧氏距离法对23份苜蓿种质进行聚类分析，可将其分为3类，第一类为强耐盐种质：包括‘中苜1号’、‘中苜5号’、‘耐盐之星’、‘WL-SALT’、‘赛迪10’、‘巨能2’、‘巨能801’和‘KRIMA’共8个品种(系)，占34.78%；第二类为中等耐盐种质：包括‘WL414’、‘3010’、‘4030’、‘601FY’、‘Hunter River’、‘皇冠’、‘皇后苜蓿’、‘金皇后’、‘苜蓿王’、‘BISTRA’和‘SOCA’共11个品种(系)，占47.83%；第三类为弱耐盐种质：包括‘中苜3号’、‘游客’、‘L3003’、‘中苜4号’共4个品种(系)，占17.39%。

图1 苜蓿发芽率、苗高、根长、发芽指数耐盐系数聚类图Fig.1 Dendrogram of different cultivars (strain) based on salt tolerance coefficient of seed germination rate,seedling height, root length and germination index

2.1.51.20%盐浓度下苜蓿种质耐盐抑制率及聚类分析 方差分析表明(表7)，1.20%NaCl盐浓

度下，不同种质间发芽率、苗高、根长和发芽指数的相对抑制率均呈极显著差异(P<0.01)，指标的相对抑制率大则说明受到盐胁迫的抑制作用弱，耐受盐胁迫的能力强，更加耐盐。从相对抑制率的值来看，发芽率的相对抑制率最高的是‘WL414’，最低的是‘中苜4号’；发芽指数相对抑制率最高的是‘巨能801’，最低的是‘L3003’；根长相对抑制率最高的是‘中苜3号’，最低的是‘金皇后’；苗高相对抑制率最高的是‘中苜4号’，最低的是‘WL414’。

以发芽率、发芽指数、根长、苗高的相对抑制率为依据，聚类分析方法同上，可将其分为3类(图2)，第一类为强耐盐种质：包括‘中苜1号’、‘中苜5号’、‘耐盐之星’、‘赛迪10’、‘巨能801’、‘苜蓿王’、‘BISTRA’和‘KRIMA’共8个品种(系)，占34.78%；第二类为中等耐盐种质：包括‘游客’、‘WL414’、‘3010’、‘4030’、‘601FY’、‘Hunter River’、‘皇冠’、‘皇后苜蓿’、‘金皇后’、‘L3003’和‘SOCA’共11个品种(系)，占47.83%；第三类为弱耐盐种质：分别是‘中苜3号’、‘WL-SALT’、‘巨能2’和‘中苜4号’共4个品种(系)，占17.39%。

表7 1.20% NaCl胁迫下苜蓿发芽率、苗高、根长、发芽指数相对抑制率差异Table 7 Effects of 1.20% NaCl stress on the inhibition rate of germination rate, seedling height, root length andgermination index of different alfalfa

图2 1.20% NaCl质量分数下各品种(系)发芽率、苗高、根长、发芽指数抑制率聚类树状图Fig.2 Dendrogram of different cultivars(strain)based on germination rate, seedling height, root length，and germination index under 1.20% NaCl stress

2.2 应用隶属函数分析法进行耐盐性综合评价

不同种质受盐胁迫影响的程度可通过隶属值反映，隶属值越大，盐造成的影响越小，植株的耐盐能力越强。以发芽率、发芽指数、根长、苗高和活力指数为依据，对23个苜蓿种质进行分析，结果表明(表8)，耐盐性排在前3位的是‘游客’、‘赛迪10’、‘中苜3号’，‘巨能801’的耐盐性最弱。

2.3 种子萌发期耐盐性评价指标的相关性分析

盐胁迫对种子发芽率、发芽指数、根长、苗高、活力指数等方面都有较明显的影响，从这些指标与盐浓度的相关性分析结果可以看出，供试苜蓿种子的发芽率、发芽指数、苗高与盐浓度成极显著负相关；‘中苜3号’根长与盐浓度成显著正相关，其余13个品种(系)根长与盐浓度成显著至极显著负相关；除‘中苜1号’、‘中苜3号’和‘巨能2’的活力指数与盐浓度相关性不显著外，其余20个品种(系)活力指数与盐浓度成显著至极显著负相关(表9)。

表8 NaCl胁迫下各品种(系)隶属函数分析Table 8 Membership function analysis of different cultivars(strain) under NaCl stress

表9 苜蓿种子萌发阶段测定指标与盐浓度的相关性分析Table 9 Correlative analysis between germination index and salt concentration in alfalfa seed germination stage

3 讨论与结论

植物耐盐性评价是一个较复杂的问题，耐盐能力的大小是多种代谢的综合表现[18]。种子的耐盐性与种子活力关系密切[8]，而种子活力主要决定于遗传以及种子发育成熟程度与贮藏期间的环境因子。遗传性决定种子活力强度的可能性，发育程度决定活力程度表现的现实性，贮藏条件则决定种子活力下降的速度。当种子处于最佳成熟时期、最适保存环境时，种子活力强，相应的耐盐能力也强。刘大林等[19]研究指出盐胁迫对种子萌发活力指数的影响大于对种子相对发芽率的影响，这一结果说明盐胁迫对苜蓿种子萌发速度的影响大于对萌发能力的影响。盐胁迫对种子发芽势、发芽率、根长、苗高等萌发特性的影响不同，即单项指标在表征耐盐性中所占的分量不同，同一指标分析相同品种可能得到不同的结果，因此任一单项指标都不能够全面评价耐盐能力。从各指标的相关性分析可以看出，测定的所有指标都存在着不同程度的相关性[20]，必须以多指标、广角度综合分析才更具科学性和可靠性。

23份苜蓿种质种子萌发及幼苗耐盐性研究结果表明，盐溶液胁迫下根和苗的生长所受影响有差异。0.40%～0.80%的低盐浓度对苜蓿根的生长有促进作用，1.00%的较高盐浓度没有明显的促进作用，盐浓度达1.20%时促进作用完全消失，明显抑制根的生长；NaCl浓度为0.40%时促进苜蓿苗的生长， 0.60%时则开始抑制苗的生长。韩清芳等[21]、王征宏等[22]认为低盐浓度促进苜蓿根的生长，本试验进一步揭示，低盐浓度促进苜蓿根和苗的生长，尤其在NaCl质量分数为0.40%时，对二者的促进作用最大，随着NaCl浓度的增加，促进作用减弱直至产生抑制作用。

种子萌发的第一步是吸水，盐浓度决定吸水，低浓度的盐溶液有调节渗透压、促进种子吸水的作用，最终促进种子萌发。高盐浓度时种子吸水不足，不能利用子叶中的储藏物质，呼吸作用受到抑制，种子难以萌发[23-24]。试验中测试种子在0.20%，0.40%，0.60% NaCl盐浓度下部分种质的种子发芽势高于对照，在0.80%及以上的NaCl处理下，种质发芽势高于对照的趋势逐渐减弱，这与马宗琪等[25]研究结论一致。NaCl浓度为1.20%和1.40%时，各苜蓿种质发芽势、发芽率、根长及苗高均达到极显著差异(P<0.01)，1.20%及以上盐浓度对于苜蓿种子萌发的抑制作用显著增强，1.20%是苜蓿耐盐性的转折点，可作为耐盐鉴定的最佳NaCl浓度。以耐盐系数和相对抑制率分别进行聚类分析，两者的聚类分析结果中，强、中、弱3类耐盐品种所占比重无变化，但每个等级中苜蓿品种发生了变动。

苜蓿萌发期受不同盐浓度溶液胁迫，指标之间所表现出的耐盐性结果存在差异，综合发芽势、发芽率、根长、苗高、发芽指数和活力指数等指标，苜蓿耐盐性由强到弱依次为：巨能2>WL414>巨能801>耐盐之星>WL-SALT>中苜1号>中苜5号>赛迪10>KRIMA>BISTRA>3010>4030>601FY>Hunter River>SOCA>金皇后>皇后苜蓿>皇冠>苜蓿王>游客>中苜3号>中苜4号>L3003。

对于试验中出现的矛盾结果，即同一指标分析相同品种得到的不同结果，在郭兴燕等[26]研究中也存在，对于此结果产生的原因将在后续的工作中，通过生理生化等指标的测定和研究，进一步分析探讨。对23个苜蓿材料种子萌发特性的研究表明，苜蓿属植物种子具有一定的耐盐性，但由于其受遗传、环境等因素的影响，不同品种间的耐盐性存在较大差异。对苜蓿耐盐性的鉴定和评价应建立在生产实践的基础上，选择科学的，具有普遍性、稳定性和适用性的耐盐性鉴定方法，运用综合的、全面的评价方法进行鉴定和评价。