肠杆菌20yhhs基因的克隆及功能分析

吴玉+谢锐萍+王雅楠+向雪梅+张欣+曹高燚

摘 要：利用基因工程方法培育草甘膦抗性作物，是当前利用草甘膦的主要途径，然而，优良草甘膦抗性基因资源的缺乏是限制抗草甘膦转基因作物发展的限制因素，挖掘新型草甘膦抗性基因资源势在必行。极端环境微生物是分离重要功能基因的资源库。研究分离获得了一株高抗草甘膦菌株肠杆菌20，为解析其高抗草甘膦胁迫的分子机制，基于非靶位点草甘膦抗性机理，利用原核表达系统鉴定了其草甘膦离子转运相关基因yhhs的功能，进而对肠杆菌20耐受高度草甘膦胁迫的分子机制进行了讨论。

关键词：肠杆菌；草甘膦；分子机理；极端环境

中图分类号：Q785 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.09.006

Abstract： Performing genetic engineering to cultivate glyphosate resistant crops was the main pathway for the current utilization of glyphosate. However， lack of excellent glyphosate resistance gene resources was limiting factor and restrict the development of glyphosate-resistant crops. So it was imperative to excavate new glyphosate resistance gene resources through various methods. Extreme environmental microbes are a repository of important functional genes. Here， a high glyphosate-resistant Enterobacter. E 20 was isolated and to be explored its mechanism of glyphosate tolerance. Based on the non-target glyphosate resistance mechanism， an transporter yhhs of Enterobacter. E 20 involved in ion transport possibly was identified and functional analyzed. Further，the molecular mechanisms of Enterobacter. E 20 for high glyphosate tolerance were well discussed.

Key words： Enterobacter； glyphosate； molecular mechanism； extreme environment

杂草问题是制约我国农作物种植面积和作物产量的重要因素之一。适时去除杂草对农作物的危害是关乎农业生产安全的重要工作。草甘膦具有高效、低毒、在环境中降解快、广谱灭生等优良特性，且制备工艺简单，使其在几十年间迅速发展成为当今农业生产中生产量及销量最大、使用面积最广的一种除草剂。同时随着现代农业和生物技术的发展，利用基因工程方法培育草甘膦抗性作物是当前利用草甘膦的主要途径[1]。

草甘膦的作用机理主要是竞争性地抑制莽草酸途径中的催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和莽草酸-3磷酸（S3P）生成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（EPSP）的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS）[2]。草甘膦是PEP的结构类似物，其作为EPSPS的抑制因子，可以占据EPSPS与底物结合的活性位点，导致莽草酸途径受阻，进而使植物体内莽草酸大量积累，最终使植物产生草甘膦毒害，达到消灭杂草的目的[3]。

植物获得草甘膦抗性，主要通过以下4个途径：（1）过量表达EPSPS。削弱草甘膦对莽草酸途径的抑制效应，达到抗草甘膦的目的[4]。（2）定点突变EPSPS。通过对EPSPS关键位点的定向改变，使其一方面增强与底物PEP和S3P的亲和能力，另一方面削弱草甘膦与EPSPS的结合作用，维持莽草酸途径的正常进行[5]。（3）降解草甘膦。来源于微生物的草甘膦乙酰转移酶或草甘膦氧化还原酶等在植物体内可以降解草甘膦，使草甘膦能够通过乙酰化作用生成无毒的肌氨酸或氨甲基膦酸，或者氧化还原生成乙醛酸和氨甲基膦酸，一定程度解除草甘膦的毒害作用[6]。（4）非靶位点草甘膦抗性途径。草甘膦并没有直接作用于EPSPS，草甘膦也没有被降解而得到解毒，而是通过温度、离子转运等途径降低了草甘膦对生物体的伤害[7]。

抗草甘膦转基因作物在国内外得到了飞速的发展。然而，困扰抗草甘膦转基因作物发展的一个重要因素就是稀缺的基因资源[8-9]，挖掘新型草甘膦抗性基因资源势在必行。非靶位点的草甘膦抗性机理更多的是涉及到草甘膦的重新包装和及时运输，使草甘膦的靶标EPSP合酶不受到明显的影响，维持莽草酸途径的正常进行，为下游分支酸及多种化合物的合成提供材料来源。

为了补充完善草甘膦抗性基因资源，本研究前期分离了一株新型草甘膦抗性菌株肠杆菌20（Enterobacter. E 20）。该菌株在营养缺陷型培养基中能够耐受高达400 mmol·L-1的草甘膦的胁迫[1]，具有分离克隆草甘膦抗性基因的潜在价值，为了挖掘草甘膦抗性相关基因，对其进行了全基因组测序（Genbank：CP012999.1）。肠杆菌20其EPSPS编码基因aroA20的草甘膦抗性并不显著[1]，为解析肠杆菌20高抗草甘膦胁迫的分子机制，基于非靶位點草甘膦抗性的作用机理，分离鉴定了肠杆菌20中一个编码膜转运蛋白的基因20 yhhs，利用原核表达系统对该基因进行了功能鉴定。endprint

1 材料和方法

1.1 试验材料

限制性内切酶购自New England Biolabs公司，普通Taq酶、TransStart FastPfu DNA Polymerase（AP222）、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒及pEASY-Blunt Simple Cloning Kit（CB111）载体购自北京全式金生物技术有限公司；各类抗生素购自北京中科瑞泰生物技术有限公司。大肠杆菌DH5α，aroA缺陷型菌株ER2799由中国农业科学院作物科学研究所玉米分子生物学实验室保存。引物由北京生工生物工程有限公司合成，序列测定由中国农业科学院作物科学研究所开放实验室测序部完成。

1.2 试验方法

1.2.1 草甘膦抗性菌株的筛选 草甘膦极端污染的土壤取自草甘膦生产工厂的废水排出处，该处土壤受到多年草甘膦的严重污染。小心取出部分土壤，用去离子水溶解，采用稀释涂板培养细菌的方法，取上清液，稀释到106，在含有不同浓度（0～400 mmol·L-1）草甘膦的M9固体培养基上进行培养。将能够生长的草甘膦抗性菌落转接划线于新的 M9 固体培养基上进行菌株纯化，最后将筛选到的草甘膦抗性菌株用液体 LB 培养基进行培养，加入15%体积比的甘油，液氮速冻后于-80 ℃保存。

1.2.2 细菌基因组DNA的提取 细菌基因组DNA提取参照北京全式金生物技术有限公司EasyPureTM Genomic DNA Kit说明书（货号EE101）进行，提取的基因组DNA储存于-20 ℃。肠杆菌20基因组测序由中国科学院北京基因组研究所完成（Genbank：CP012999.1）。

1.2.3 细菌16Sr DNA的扩增 提取细菌基因组DNA后，用16Sr DNA引物进行扩增，鉴定微生物所属的类型。所用引物为：上游5‘-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3；下游5‘-TACG GTTACCTTGTTACG ACTT-3。PCR反应体系为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30次；72 ℃ 5 min；4 ℃保温。PCR扩增片段经DNA纯化试剂盒纯化后连接T载体进行测序，并在NCBI 在线网站中进行序列比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.2.4 20 yhhs的扩增及原核表达载体构建 基于肠杆菌20全基因组测序结果，鉴定20 yhhs基因序列（Genbank：ALL19477.1），利用Clontech公司的In-Fusion连接系统（In-Fusion？誖 PCR Cloning System），构建原核表达载体pUC19-20yhhs。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环30次；72 ℃ 5 min；4 ℃保温。所用引物为：Infu- puc- 20yhhs-BamH：CGGTACCCGGGGATCCGA TGCCCGAACCTGCCGCT；Infu-puc-20yhhs-Sal：ATGCCTGCAGGTCGACTCACGACG ATGACGTGGCCT。

PCR扩增产物经电泳检测后，直接取PCR原液进行In-Fusion反应，连接至经BamHI/SalI消化的pUC19线性载体片段上，转化ER2799，涂布在含有AMP的固体LB培养基上，并通过测序进行验证。

1.2.5 20 yhhs重组菌株的草甘膦抗性鉴定 质粒pUC-20yhhs及对照质粒pUC19分别转化ER2799，选取同批次转化的单克隆菌落用含AMP的液体LB培养基培养，之后转接等量菌液至含有不同浓度草甘膦的液体M9培养基中，37 ℃下200 rpm中振荡培养，监测重组菌株生长曲线，评价其草甘膦抗性。

2 结果与分析

2.1 草甘膦抗性菌株的分离鉴定

通过稀释平板法，获得了数个具有高度耐受草甘膦胁迫的菌斑，对这些菌斑进行了转接纯化，并用不含抗生素的LB液体培养基重新培养，获得的纯化菌株保存于-70 ℃。重点集中于一株能够稳定耐受高达400 mmol·L-1草甘膦胁迫的菌株，根据鉴定顺序，将其命名为20（图1）。

2.2 细菌基因组DNA的提取及16Sr DNA的鉴定

新分离的20号菌株用不含抗生素的LB培养基重新培养，收集菌液，提取20号菌株的基因组DNA，用16Sr DNA鉴定其所属种。在 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/中 对 菌 株20的16Sr DNA进行序列比对，结果显示，20菌株很可能是一種肠杆菌，与多个Enterobacter具有较近的亲缘关系，其在 NCBI 中的比对结果如表 1 所示。

2.3 20 yhhs基因的克隆及原核表达载体构建

20菌株是一种肠杆菌，其与模式菌株大肠杆菌K12（E.coli. K12）具有较近的亲缘关系，而野生型的K12对草甘膦敏感。肠杆菌20其EPSPS编码基因在之前的鉴定中并未显示出草甘膦抗性[1]，基于此，推测其可能通过非靶位点途径获得草甘膦抗性。

大肠杆菌 yhhs基因编码一个膜转运蛋白，在大肠杆菌及假单胞菌中过表达yhhs基因，可以通过离子转运的作用降低草甘膦对细胞的伤害[10]。肠杆菌20由北京基因组研究所采用新一代测序技术进行全基因组测序（Genbank：CP012999.1），因此扫描肠杆菌20基因组测序结果，以肠杆菌20基因组DNA为模板，获得了20 yhhs基因（Genbank：ALL19477.1）（图2）。该基因全长1 218 bp，编码405个氨基酸。基于In-Fusion介导的载体构建策略，将该基因克隆至原核表达载体pUC19的BamHI/ SalI酶切位点之间，并在基因起始密码子前添加一碱基G，以利用载体自身的启动子驱动该基因的表达，构建载体pUC-20yhhs（图3），载体经测序验证正确。endprint

2.4 20 yhhs重组菌株的草甘膦抗性鉴定

为鉴定20 yhhs重组菌株的草甘膦抗性，选择同批次转化的重组菌株的单克隆，在含AMP的液体LB培养基中培养至OD600为0.5，之后选取等量的菌液转接入含不同浓度草甘膦的M9液体培养基中，草甘膦浓度分别设为0，100，200， 300 mmol·L-1，于37 ℃，220 rpm下振荡培养，并在不同的时间点取样测定OD600，评价重组菌株对草甘膦的耐受性。

ER2799不具有在草甘膦胁迫下在缺陷型培养基中生长的能力[11]，从图4可以看出，含质粒pUC19及pUC-20yhhs的重组菌株在不同浓度草甘膦的胁迫下，都未体现出对草甘膦的耐受型，重组菌株一直处于严重的抑制状态下。说明20 yhhs并未通过离子转运作用赋予重组菌株草甘膦抗性，肠杆菌20高抗草甘膦的作用机制还有待进一步研究。

3 结论与讨论

极端环境微生物是获得重要抗性基因的来源，有报道表明，大量参与耐重金属、低温、高温及草甘膦胁迫的功能基因被克隆并被广泛地应用[11]。在草甘膦抗性植物研究领域，由土壤农杆菌分离而来的CP4被广泛应用于抗草甘膦转基因作物的培育，由于其100位氨基酸为特异的Ala，而不同于大多数I型EPSPS为Gly及II型EPSPS为Ser，独特的空间构型增强了与底物PEP及S3P的亲和能力，而同时降低了草甘膦对EPSPS的抑制[11]。

莽草酸途径广泛存在于植物、微生物及真菌中，其中，莽草酸是很多化合物合成的前体，成为很多抗菌剂、活性疫苗及除草剂的重要靶标[12]。EPSPS是莽草酸途径中催化S3P和PEP合成EPSP的关键酶，草甘膦作为PEP的结构类似物，会竞争性地抑制EPSPS的活性，进而影响莽草酸途径的正常进行，严重的会导致生物体死亡，因此，草甘膦抗性研究的热点较大程度地集中于EPSPS。

肠杆菌20是从草甘膦极端污染土壤中分离而来的菌株，16Sr DNA鉴定结果显示其为肠杆菌[1]。为了探究其高度耐受草甘膦胁迫的分子机制，对其进行了全基因组测序（Genbank：CP012999.1），并分离了其EPSPS编码基因aroA20，进化分析显示，20 EPSPS为I型EPSPS，然而，对aroA20进行初步的草甘膦抗性鉴定，并未显示其具有显著的草甘膦耐受性[1]。

非靶位点草甘膦抗性是生物体获得抗草甘膦能力的另外一条重要途徑[13-14]，非靶位点草甘膦抗性机制的研究更多地集中于欧美及澳大利亚等地区出现的草甘膦抗性杂草上。草甘膦抗性杂草相对于敏感杂草，有比较强的草甘膦转运能力，可将草甘膦转移至EPSP合酶的非主要作用细胞器（如液泡），随之进行解毒，避免过多的草甘膦进入叶绿体，从而解除草甘膦对自身的伤害[7]。因此，挖掘转运和解毒草甘膦的关键基因，对于研究非靶位点草甘膦抗性机制具有重要的意义，并为作物耐草甘膦育种提供理论依据。yhhs基因作为离子转运蛋白，过表达可以赋予大肠杆菌及假单胞菌耐受草甘膦的能力[10]，然而，本研究结果表明，20 yhhs在原核表达系统中却并未赋予肠杆菌20高抗草甘膦的能力。

肠杆菌20高抗草甘膦胁迫，而其草甘膦抗性并未通过yhhs基因的离子转运作用获得。通过扫描肠杆菌20全基因组数据，并结合草甘膦胁迫下肠杆菌20基因的表达谱，将有助于阐明肠杆菌20高度耐受草甘膦胁迫的分子机制。

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