远志多糖的分离纯化、结构特征及生物活性

景永帅，张丹参，吴兰芳*，郑玉光

（1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北中医学院药学院，河北 石家庄 050200）

远志多糖的分离纯化、结构特征及生物活性

景永帅1，张丹参1，吴兰芳2,*，郑玉光2

（1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018；2.河北中医学院药学院，河北 石家庄 050200）

目的：分离纯化远志多糖（polysaccharide of Polygala tenuifolia，PTP），并对其理化性质、抗氧化和降血糖活性进行研究。方法：采用超声波辅助提取、分级醇沉、DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱色谱分离纯化远志多糖；紫外-可见光谱扫描法、比旋光度法、凝胶渗透色谱法3 种方法验证纯度；高效凝胶渗透色谱法测定相对分子质量，高效阴离子交换色谱测定单糖组成；清除1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羟自由基评价体外抗氧化活性；测定对α-葡萄糖苷酶抑制能力以研究其降血糖活性。结果：远志多糖经分离纯化后获得组分PTP-1，经3 种方法验证PTP-1为均一性良好的多糖，相对分子质量为4.62×104，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成，物质的量比为3.92∶1.00∶2.08。抗氧化活性研究结果表明，PTP-1对清除DPPH自由基和羟自由基呈良好的量效关系，半数清除率浓度IC50分别为0.35 mg/mL和0.51 mg/mL。降血糖活性结果表明，PTP-1对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制能力，IC50值为0.52 mg/mL。结论：远志多糖PTP-1为具有抗氧化和降血糖活性的均一多糖。

远志；多糖；理化性质；抗氧化活性；降血糖活性

景永帅, 张丹参, 吴兰芳, 等. 远志多糖的分离纯化、结构特征及生物活性[J]. 食品科学, 2017, 38(17): 126-131.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717021. http://www.spkx.net.cn

JING Yongshuai, ZHANG Danshen, WU Lanfang, et al. Purifi cation and structural characterization of polysaccharide from Polygala tenuifolia and its biological activity[J]. Food Science, 2017, 38(17): 126-131. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717021. http://www.spkx.net.cn

远志为远志科植物远志（Polygala tenuifolia Willd.）的干燥根，具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿等功效[1]，已报道的化学成分主要包含三萜皂苷类、糖类、☒酮类，也含有少量的生物碱、香豆素、木质素类等[2-3]。远志始记载于《神农本草经》，被视为上品，为常用的药食两用资源，现代医学研究表明远志具有抗老年痴呆、抗抑郁、抗肿瘤、抗氧化以及改善记忆能力等作用[4-6]。

近年来，随着多糖研究的深入，植物多糖的多种生物活性逐渐被发现，包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖以及抗病毒等，而且中药多糖含量丰富，来源广泛，细胞毒性低，是一种理想的保健食品开发来源[7]。据文献调研，目前对于远志的研究主要集中在皂苷、挥发油、寡糖酯和生物碱等成分及其药理活性的研究，而对于其多糖的研究报道较少，如Xin Tao等[8]从远志中分离得到2 个酸性多糖，可增强荷瘤小鼠的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活力，且具有较好的抑制肺腺癌细A549的作用；另外，包括远志多糖的含量测定[9-10]和提取工艺[6]等方面的研究。但对于远志纯化多糖的结构表征、抗氧化以及降血糖活性等方面研究鲜见报道。

因此，本实验在前期提取工艺及抗氧化活性追踪的基础上[6]，对远志多糖进行分离纯化，并对其理化性质及其抗氧化和降血糖活性进行研究，旨在为更好地开发和利用远志中的多糖组分，同时可为明确远志的活性物质基础提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

远志购自河北安国药材市场，经河北中医学院郑玉光教授鉴定为远志科植物远志（Polygala tenuifolia Willd.）的干燥根。

DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100、Sephacryl S-300 HR 美国GE Healthcare公司；标准品葡聚糖Dextran系列（T4、T7、T10、T70、T200）、蓝葡聚糖、各标准单糖、1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG） 美国Sigma公司；阿卡波糖德国拜耳公司；其他化学试剂为进口或国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DBS-100自动部分收集器、恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；EYELA N-1000旋转蒸发仪日本东京理化器械公司；QP2010气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪、TU-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；WZZ-2B自动旋光仪 上海精密科学仪器厂；Dionex ICS-2500高效离子色谱 美国戴安公司；3110型酶标仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 远志粗多糖的提取

准确称取远志粉末500 g，使用10 倍体积的95%食用乙醇回流提取2 次，每次2 h，以除去其中的脂溶性成分，过滤后取滤渣风干，备用。称量醇提后的远志残渣430 g，加入10 倍体积的蒸馏水提取，在超声波辅助的条件下，67 ℃恒温提取2 次，每次0.5 h，合并水提液，用旋转蒸发仪减压浓缩至一定体积，使用4 倍体积的无水乙醇沉淀（乙醇终体积分数为80%），4 ℃静置24 h，离心，沉淀为粗多糖PTP80[6]。PTP80使用木瓜蛋白酶结合Sevag法除蛋白，用XAD-7型大孔树脂进行脱色处理，分别用自来水、蒸馏水各透析48 h[11]，减压浓缩，真空冷冻干燥后得到远志粗多糖PTP。

1.3.2 远志粗多糖的分离纯化

将粗多糖溶于少量蒸馏水中，配制成50 mg/mL多糖溶液，在多糖分离纯化系统上，采用DEAE-cellulose 52柱（4.0 cm×80.0 cm）以0.0～1.0 mol/L NaCl线性洗脱，根据线性洗脱结果确定梯度洗脱的条件，自动部分收集（每管收集5.0 mL），以苯酚-硫酸法检测各梯度中多糖组分的位置，分别收集相应梯度的多糖组分，透析脱盐后浓缩冻干得纯化后多糖样品，下一步采用Sephadex G-100柱（2.6 cm×100.0 cm）以蒸馏水为洗脱液，自动部分收集（每管收集3.0 mL），以苯酚-硫酸法检测多糖洗脱情况，分别收集相应的多糖组分，透析后浓缩冻干，得纯化后多糖样品。

1.3.3 远志多糖的纯度验证

1.3.3.1 紫外-可见光谱分析

将样品配制成质量浓度为1.0 mg/mL的溶液，在200～700 nm波长范围内进行扫描。

1.3.3.2 比旋光度法分析

在20 ℃钠光下，分别使用体积分数30%、60%、80%的乙醇沉淀多糖溶液，测定沉淀物的旋光度值。

1.3.3.3 凝胶渗透色谱法分析

样品上样于Sephacryl S-300 HR凝胶柱，以蒸馏水为洗脱液，苯酚-硫酸法检测多糖洗脱情况，以流出液的管数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线[12]。

1.3.4 远志多糖分子质量测定

采用高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）测定远志多糖PTP-1的相对分子质量（Mr）[12]。以T系列葡聚糖T4、T7、T10、T70、T200制作标准曲线，用Mr为200万的蓝葡聚糖确定凝胶柱的空体积V0，以葡萄糖确定凝胶柱的总柱体积Vt，以有效分配系数Kav为纵坐标，lgMr为横坐标作标准曲线，分配系数Kav根据公式（1）计算。

式中：Ve为待测样品的洗脱体积/mL；V0为色谱柱空体积/mL；Vt为色谱柱总体积/mL。

配制成质量浓度为2.0 mg/mL的多糖PTP-1溶液，上Sephacyl S-300 HR凝胶柱，根据出峰体积，计算Kav，代入上述标准曲线中，可计算PTP-1的Mr。

1.3.5 远志多糖的理化性质测定

采用硫酸-苯酚法[12]测定总糖含量；采用Folin-酚法[13]测定蛋白含量；采用咔唑-硫酸法[14]测定糖醛酸含量；采用氯化钡-明胶比浊法[15]测定硫酸根含量；自动旋光仪测定其比旋光度[11]。

1.3.6 远志多糖的红外光谱分析

称取1.0 mg远志多糖PTP-1，以KBr混合研磨成粉，压片，在4 000～400 cm－1范围内进行红外光谱扫描[11]。

1.3.7 远志多糖的DSC-TGA分析

称取10.0 mg的远志多糖PTP-1，温度由室温升至800 ℃，升温速率为10 ℃/min，进行热重分析，包括差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）法和热重分析（thermal gravimetric analysis，TGA）。以温度为X轴，以质量损失率（某一温度下失质量后样品的实测质量与样品总质量的比值）为Y轴，绘制热重变化曲线。

1.3.8 远志多糖的单糖组成分析

配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液（L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-岩藻糖、D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖），量取20.0 μL进行高效阴离子交换色谱-脉冲电流探测（high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法测定。称取PTP-1多糖2.0 mg，加入2.0 mL的2 mol/L三氟乙酸（trifi uoroacetic acid，TFA），封管后110 ℃水解6 h，减压浓缩蒸干TFA，加入适量蒸馏水溶解，取20.0 μL进行HPAEC-PAD测定，根据各峰的保留时间和峰面积比计算出各单糖的组成和物质的量比[13]。

1.3.9 远志多糖的甲基化反应及GC-MS分析

甲基化反应的方法，参考改良的Hakomori法及文献[11,13]方法进行，反应产物经红外光谱检测，在3 500～3 300 cm－1处无羟基的特征吸收峰，说明样品甲基化完全。取甲基化完全的多糖样品，依次使用TFA水解，硼氢化钠还原，醋酸酐乙酰化后，对乙酰化产物进行GC-MS分析。

1.3.10 远志多糖的抗氧化活性测定

远志多糖清除DPPH自由基、羟自由基（•OH）的测定参照文献[16-18]方法进行测定。

1.3.11 体外降血糖活性测定

[19]方法，以PNPG为底物，测定α-葡萄糖苷酶的活性。具体操作为：以pH 6.8的磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）配制反应液，PTP-1（0.05～6.4 mg/mL）和阿卡波糖（0.05～6.4 mg/mL）分别与α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）20 μL混匀，37 ℃孵育10 min，再加入底物5 mmol /L PNPG 20 μL，混匀，37 ℃反应30 min 后，加入0.2 mol/L Na2CO3终止反应。反应产物于405 nm波长处测定吸光度。以等体积溶剂PBS作为空白对照，阿卡波糖作为阳性对照。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率根据公式（2）计算。

式中：A0为以等量PBS代替样品溶液的吸光度；AS为加入PTP-1或阿卡波糖溶液反应后的吸光度。

2 结果与分析

2.1 远志多糖的提取、分离和纯化

远志经乙醇除脂、超声波辅助提取、乙醇沉淀、除蛋白质、除色素、透析冻干后，得到远志粗多糖PTP 27.3 g，提取率为5.46%。粗多糖PTP经DEAE-cellulose 52离子交换柱分离，分别在水洗脱与梯度盐洗脱部分得到2 个主峰，分别为PTP-A和PTP-B。选取PTP-B为下一步分离对象，经Sephadex G-100凝胶柱纯化，得到对称的单峰组分，透析后浓缩冻干得纯化后多糖样品PTP-1。

2.2 远志多糖的纯度验证

紫外-可见分光光度计结果表明，PTP-1在260 nm和280 nm波长处均无明显特征吸收，说明多糖中不含有蛋白质和核酸，在620 nm波长处无吸收峰则表明不含色素类物质。在3 种乙醇体积分数下，PTP-1的比旋光度基本相同，分别为：＋71.7°、＋71.4°、＋72.0°，表明其为相对均一多糖。

图 1 PTP-1的Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析洗脱曲线Fig. 1 Elution profi le of PTP-1 in Sephacryl S-300 HR column

由图1可知，分离纯化后的PTP-1在Sephacryl S-300 HR凝胶柱层析中获得单一、对称的洗脱峰。经紫外-可见光谱扫描法、比旋光度法、HPGPC验证多糖PTP-1的纯度，表明PTP-1为均一性良好的多糖。

2.3 远志多糖相对分子质量及理化性质

根据葡聚糖Dextran系列制作标准曲线的回归方程为：Y=－0.439 3X＋14.010 0（R2=0.998 9）。计算出PTP-1的相对分子质量为4.62×104。理化性质分析结果表明：远志多糖PTP-1为总糖含量为98.6%，比旋光度平均值为＋71.7°，且不含有蛋白、糖醛酸和硫酸根的中性多糖。

2.4 远志多糖的红外光谱分析

图 2 远志多糖PTP-1的红外光谱图Fig. 2 FT-IR spectrum of PTP-1

如图2所示，3 420 cm－1附近处强吸收峰为—OH的伸缩振动峰；在2 960、1 652、1 403、1 190、1 065 cm－1处的吸收均为多糖的特征吸收，824 cm－1和896 cm－1处的吸收显示在结构中同时含有α和β两种糖苷键构型存在[16]。

2.5 远志多糖的DSC-TGA分析

图 3 PTP-1的热重分析曲线Fig. 3 DSC-TGA curve of PTP-1

由图3可知，远志多糖PTP-1有4 次明显的质量损失过程。第1次质量损失出现在100 ℃左右，质量损失率为7.495%，推测其可能是多糖受热失去部分吸附水造成的；第2次质量损失出现在200 ℃左右，质量损失率为9.497%，推测其可能是多糖受热失去层间结合水或胶体水造成的；第3次质量损失出现在250～600 ℃，质量损失率为48.77%，在此温度区间内多糖快速质量损失，表明PTP-1在该温度区间内发生了剧烈的分解，推测为碳链和氢键断裂造成的；600 ℃以后，质量损失趋势减缓，PTP-1进一步分解。

2.6 远志多糖的单糖组成分析

图 4 标准单糖的高效离子色谱图Fig. 4 HPAEC-PAD chromatograms of standard monosaccharides

图 5 PTP-1完全酸水解的高效离子色谱图Fig. 5 HPAEC-PAD chromatogram of PTP-1

经与标准单糖的高效离子色谱保留时间和峰面积对照分析（图4、5），结果表明：PTP-1由半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）组成，其物质的量比为3.92∶1.00∶2.08。

2.7 远志多糖的甲基化分析

表 1 远志多糖PTP-1甲基化分析Table 1 Methylation analysis of PTP-1

根据Hakomori法对远志多糖PTP-1进行甲基化5 次后，进行红外光谱分析，在3 600～3 300 cm－1范围内无—OH的特征吸收峰，说明样品甲基化完全。对乙酰化产物进行GC-MS分析，结果见表1，结果表明，PTP-1由3 种单糖：Gal、Glc、Man组成，这与HPAEC-PAD单糖组成分析结果一致，其中，Gal主要以1→键型存在，Man主要以1→4键型存在，Glc主要以1→3,6、1→6键型存在。根据以上结果可以推测，构成PTP-1的主链为1→4连接的Man和1→6连接的Glc，该糖链的分枝点残基为1,3,6→Glc，分枝点应在O-6上；Gal构成糖链的末端。

2.8 远志多糖的抗氧化活性

图 6 远志多糖PTP-1和VC对DPPH自由基的清除活性Fig. 6 DPPH radical scavenging activity of PTP-1 and VC

由图6可知，在一定质量浓度范围内，随着多糖质量浓度的增加，对DPPH自由基清除率逐渐增加，其中，在质量浓度为0.8 mg/mL时，远志多糖的清除率达到72.8%，但清除率低于VC。远志多糖PTP-1和VC对DPPH自由基的半数清除率浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为0.35 mg/mL和0.15 mg/mL。

图 7 远志多糖PTP-1和VC对 OH的清除活性Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging activity of PTP-1 and VC

如图7所示，在一定质量浓度范围内，随着PTP-1质量浓度的增加，对•OH清除率逐渐增加，呈现一定的量效关系。其中，在质量浓度为0.8 mg/mL时，远志多糖的清除率达到63.3%，但清除效果不如对照品VC明显。PTP-1和VC对•OH清除率的IC50值分别为0.51 mg/mL和0.16 mg/mL。

体外抗氧化研究结果表明，远志多糖具有较强的清除自由基的能力，推测可能与多糖分子含有的单糖种类和糖苷键连接方式有关，多糖分子中含有大量的羟基，羟基上的氢和化学性质活泼的•OH反应，生成稳定碳自由基和水，达到清除•OH的目的；或者多糖环上的羟基可与产生•OH等所必需的金属离子（如Fe2＋、Cu2＋等）络合，使其不能产生启动脂质过氧化的•OH，从而抑制活性自由基的产生[20]。另外，多糖自身大分子具有空间结构，可对DPPH自由基或•OH产生包合作用，从而抑制自由基反应[21]。如封燕等[22]报道的金蝉花多糖由Glc、Man和Gal组成，当质量浓度为0.8 mg/mL时，对DPPH自由基和•OH的清除率分别为79.16%和94.12%，和本研究的结果相一致。

2.9 远志多糖的体外降血糖活性

表 2 阿卡波糖及远志多糖PTP-1对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 2 Inhibitory effects of PTP-1 and acarbose on α-glucosidase activity

如表2所示，PTP-1对α-葡萄糖苷酶的抑制活性随质量浓度增加而增大，在6.40 mg/mL时达到81.66%。计算得到阿卡波糖的IC50值为0.45 mg/mL，PTP-1与阿卡波糖的IC50值较为接近，为0.52 mg/mL。由结果可知，PTP-1具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究者发现，荔枝多糖、蛹虫草多糖以及南瓜多糖等具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并且这些活性多糖主要由Gal、Glc、Man等构成，如蛹虫草多糖由Gal、Glc、Man组成，比例为3.22∶39.90∶2.39[23]；南瓜多糖也由Man、Glc、Gal组成，比例为5.50∶1.00∶7.47[24]；荔枝多糖主要是由Glc、Gal、Man、阿拉伯糖、鼠李糖等组成[25]，本实验的中远志多糖由Gal、Glc、Man组成，比例为3.92∶1.00∶2.08，具有较强的对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，与文献报道的单糖组成相似，只是单糖组成比例有所不同。

3 结 论

采用超声波辅助提取法、经过分级醇沉、除蛋白、除色素、透析、冷冻干燥后得到远志粗多糖。远志粗多糖经DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱依次分离纯化得到组分PTP-1，采用3 种方法验证了其纯度，表明远志多糖PTP-1为均一性良好的多糖。PTP-1的相对分子质量为4.62×104，是由Gal、Glc、Man组成，物质的量比为：3.92∶1.00∶2.08，总糖含量为98.6%，比旋光度平均值为＋71.7°，且不含有蛋白质、糖醛酸和硫酸根的中性多糖。

抗氧化活性结果表明，在一定的质量浓度范围内远志多糖PTP-1对DPPH自由基和•OH均具有明显的剂量效应，IC50值分别为0.35 mg/mL和0.51 mg/mL，相对于远志粗多糖清除DPPH自由基和•OH的IC50值分别为0.83、1.29 mg/mL[5]，纯化后抗氧化能力得到提高，说明远志多糖具有较强的抗氧化能力，推测可能与多糖分子中含有的单糖种类、糖苷键连接方式、羟基基团以及空间结构等相关。降血糖活性研究表明，远志多糖PTP-1具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值为0.52 mg/mL，说明远志多糖与α-葡萄糖苷酶形成竞争抑制效应可能是远志降血糖的途径之一。远志多糖PTP-1以其优良的抗氧化和降血糖活性在医药、保健品及化妆品工业中拥有一定的潜力，本研究可为远志的深加工和进一步研究开发提供一定的理论依据。

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Purifi cation and Structural Characterization of Polysaccharide from Polygala tenuifolia and Its Biological Activity

JING Yongshuai1, ZHANG Danshen1, WU Lanfang2,*, ZHENG Yuguang2
(1. College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. College of Pharmacology, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China)

Objective: To isolate and purify a polysaccharide from dried roots of Polygala tenuifolia and to determine its physicochemical properties and biological activity. Methods: The purified polysaccharide was obtained by ultrasonicassisted extraction, alcohol fractional precipitation, deproteinization, decolorization, dialysis, DEAE-cellulose 52 and Sephadex G-100 gel column chromatography. The purity of the final purified product was determined by UV-visible spectroscopy, spin spectrophotometry and gel filtration chromatography (GPC). The relative molecular mass of the polysaccharide was determined by high performance gel permeation chromatography, the monosaccharide composition was analyzed by high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD), the antioxidant activity was evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and hydroxyl free radical scavenging assays, and the hypoglycemic activity was evaluated by α-glucosidase-inhibiting activity. Results: A homogeneous polysaccharide (PTP-1) was obtained. The relative molecular mass of PTP-1 was 4.62 × 104. Its monosaccharide composition was composed of galactose, glucose and mannose with a molar ratio of 3.92:1.00:2.08. The polysaccharide showed DPPH and hydroxyl radical scavenging capacity in a dose-dependent manner in a certain concentration range, with IC50of 0.35 and 0.51 mg/mL, respectively. In addition, it was able to signifi cantly inhibit α-glucosidase activity with IC50 of 0.52 mg/mL. Conclusion: PTP-1 is a pure polysaccharide with antioxidant and hypoglycemic activity.

Polygala tenuifolia; polysaccharide; physicochemical property; antioxidant activity; hypoglycemic activity

10.7506/spkx1002-6630-201717021

TS201.2

A

1002-6630（2017）17-0126-06引文格式：

2016-08-01

河北省自然科学基金项目（H2016208059；H2016208058；H2017423023）；河北省教育厅高等学校科学技术研究项目（QN2016187；QN2016099；ZD2016009）；河北省食药监局食品药品安全科技项目（QN2015016；QN2016013）

景永帅（1985—），男，讲师，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：cjys1985@126.com

*通信作者：吴兰芳（1985—），女，讲师，博士，研究方向为药食两用资源开发与利用。E-mail：wulanfang757@163.com