乳酸菌对苜蓿草粉发酵品质的影响

乔宏兴，史洪涛，王永芬，姜亚乐，边传周

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046； 2.郑州市益生菌发酵中药重点实验室，河南 郑州 450046；3.河南省益生菌生物转化工程技术研究中心，河南 郑州 450046； 4.河南省洛阳市孟津县畜牧局，河南 洛阳 471100)

乳酸菌对苜蓿草粉发酵品质的影响

乔宏兴1,2,3，史洪涛1,2,3，王永芬1，姜亚乐4，边传周1,2,3

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046； 2.郑州市益生菌发酵中药重点实验室，河南 郑州 450046；3.河南省益生菌生物转化工程技术研究中心，河南 郑州 450046； 4.河南省洛阳市孟津县畜牧局，河南 洛阳 471100)

通过为期60 d的发酵，探讨添加乳酸菌对苜蓿(Medicagosativa)草粉发酵品质的影响。试验设4个处理，分别为添加无菌水(对照)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，LP)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium，EF)和植物乳杆菌+屎肠球菌(LP+EF)发酵苜蓿草粉，设5个时间点采样进行相关项目测定。结果表明，与对照组相比，发酵60 d时各试验组发酵苜蓿草粉的评分提高，总酸含量显著升高(P<0.05)，pH显著降低；LP、LP+EF和对照组的干物质含量明显低于EF组；各试验组酸性洗涤纤维含量明显低于对照组；有氧暴露7 d后，各试验组的pH均显著低于对照组、总酸含量均显著高于对照组(P<0.05)，且只有对照组中检测到酵母菌(Saccharomycetes)和霉菌(Mycete)。综上可知，添加乳酸菌对苜蓿草粉的发酵品质、稳定性及营养组成具有良好的改善作用。

植物乳杆菌；屎肠球菌；苜蓿；发酵；发酵品质；有氧稳定性；成分分析

紫花苜蓿(Medicagosativa)营养丰富、适口性好，对多种动物的生长、繁殖性能以及肠道微生物菌群的改善具有促进作用，是一种优质的饲料原料[1]，在世界范围内广泛种植，故有“饲料皇后”和“牧草之王”的美称[2-3]。利用现代微生物发酵技术，在苜蓿发酵过程中能产生大量的菌体以及酶、有机酸、维生素和细菌素等有益代谢产物，使苜蓿的营养更全面并具备新的功能，如调节肠道菌群平衡、提高饲料利用率和机体免疫力等，使其在动物生产上的推广应用价值大幅提升[4-5]。目前，关于苜蓿的研究主要集中在提高青贮品质方面，利用乳酸菌发酵苜蓿干草粉及对发酵品质影响的研究较少。本研究利用乳酸菌对苜蓿草粉进行生物发酵，探讨发酵产物中的营养成分、乳酸菌及其代谢产物的变化，为提高苜蓿草粉的品质以及生物饲料添加剂的研究与开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂 MRS肉汤、MRS琼脂和马铃薯培养基均购于北京澳博星生物技术有限公司。

1.1.2 发酵菌种 发酵菌种为植物乳杆菌、屎肠球菌(由河南牧业经济学院郑州市益生菌发酵中药重点实验室提供)，菌种所含活菌数均为1×108cfu·mL-1。

1.1.3 发酵原料 新鲜的苜蓿(取自新密市苜蓿草生产基地)，现蕾期刈割，用铡草机铡成约2 cm的小段，适当晾晒后置于60 ℃烘箱中烘24 h。将苜蓿干草(茎叶比约为2∶1)粉碎使其粒径约为0.613 mm，密封保存备用。苜蓿草粉的成分：干物质(DM)含量94.32%，酸性洗涤纤维(ADF)含量33.46%，中性洗涤纤维(NDF)含量36.98%，总酸含量12.58 g·kg-1，含水量约8%。

1.2 试验设计

设置4个处理，分别为添加无菌水(对照)、植物乳杆菌(LP)、屎肠球菌(EF)和植物乳杆菌+屎肠球菌(LP+EF) (混合比例为1︰1)发酵苜蓿草粉。准确称量330 g 苜蓿草粉、发酵菌种和无菌水，草粉、菌种、无菌水的质量比为6∶1∶2，各处理混合均匀后，装进发酵袋密封，每袋500 g，置于30 ℃恒温培养箱中发酵培养。分别在发酵3、7、15、30和60 d时采集样品，于-20 ℃冰箱中保存备用。每个时间点各处理设3个重复，共采集60份样品。

发酵完成后(60 d)分别取各处理200 g样品，各处理组分别装入3个已灭菌的500 mL烧瓶中，敞口放置于37 ℃的恒温培养箱中，分别于暴露的第3天和第7天测定样品中微生物和有机酸的含量，每个处理3个重复。

1.3 项目测定

1.3.1 苜蓿发酵后的感官评定 发酵60 d后打开发酵袋，对各处理样品进行感官评定，参照德国农业协会(Deutche Landwirtschafts Geseutschaft,DLG)对青贮品质感官评分标准进行评定，分别从气味、质地和色泽3个方面进行等级评定[6]。气味分5级，对应为0～14分；质地分4级，对应为0～4分；色泽分3级，对应为0～2分。然后综合3项得分给出评分结果：Ⅰ,优良(16～20分);Ⅱ，尚好(15～15分);Ⅲ，中等(5～9分);Ⅳ，腐败(0～4分)4个等级(表1)。

1.3.2 活菌数的测定 乳酸菌检测按照GB 4789.35-2016食品安全国家标准检测[7]，霉菌和酵母菌检测按照GB 4789.15-2016食品安全国家标准所提供的方法进行测定[8]。

1.3.3 pH的测定 准确称取25 g发酵样品，加入225 mL生理盐水，浸泡30 min，用搅拌机匀质30 s，先后用4层纱布和定量滤纸过滤，用酸度计测定滤液pH[9]。

1.3.4 发酵样品成分测定 水分测定参考GB/T 6435-2014 饲料中水分的测定方法标准[10]；Crude protein(CP)测定参考GB/T 6432-1994 饲料中粗蛋白测定方法标准[11]；Neutral detergent fiber(NDF)参考GB/T 20806-2006 饲料中中性洗涤纤维的测定方法进行测定[12]；Acid detergent fiber(ADF)按照NY/T 1459-2007 饲料中酸性洗涤纤维的测定方法进行测定[13]；总酸按照GB/T 12456-2008 食品中对应总酸的测定方法进行测定[14]。

1.4 数据分析

数据采用SPSS 19.0统计软件对试验数据进行显著性分析，试验结果数据以平均值表示，以P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 苜蓿发酵后的感官评定

各处理在色泽方面均为黄绿色，2分；质地方面也无明显差异，未出现霉变、粘手现象，4分；气味方面，对照组样品具有丁酸臭味，酸香气味较淡，8分，其它处理组酸香气味较浓评分为14分。综合评分结果，除对照组感官评分为2级尚好以外，其它处理组苜蓿草粉发酵后的感官评分均为1级优良。

2.2 苜蓿草粉发酵过程中微生物、pH和总酸含量的动态变化

各处理组发酵样品在各取样时间点均无霉菌、酵母菌生长，而对照组在3、7、15 d时均检测到酵母菌(表3)。发酵3 d时，对照组乳酸菌数量(0.20×108cfu·g-1)显著低于其它各处理组(P<0.05)，植物乳杆菌处理的数量最多，为15.37×108cfu·g-1；发酵7 d时，对照组乳酸菌数量为6.13×108cfu·g-1，仍显著低于同时间点的其它处理组；发酵30和60 d时，对照和各处理组均未检测到乳酸菌。

对照组和其它处理组的pH均随发酵时间的延长而明显变小(表3)。且各处理时间点处理组的pH均显著低于对照组(P<0.05)。15 d以后各处理组的pH基本稳定，各处理组间差异不显著(P>0.05)。

表1 青贮苜蓿感官评定综合评分标准Table 1 The composite sensory assessment scores of Medicago sativa stalk silage samples

表2 苜蓿草粉发酵60 d后的感官评定结果Table 2 Results of sensory evaluation of fermented alfalfa meal samples

注：CK，无菌水(对照组)；LP，植物乳杆菌组；EF，屎肠球菌组；LP+EF，植物乳杆菌+屎肠球菌。下同。

Note: CK, sterile water (control group); LP, plant-derivedLactobacillus; EF, excrement-derivedEnterococcus; LP + EF, plant-derivedLactobacillusand excrement-derivedEnterococcus; similarly for the following tables.

表3 发酵产物中微生物及总酸的含量测定结果Table 3 Results of microbe counts and total acid production

注：同列不同小写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters for the same time within the same column indicate significant differences among the experimental groups at the 0.05 level; similarly for the following tables.

在各处理时间点，对照组的总酸含量均显著低于其它处理组的(P<0.05)，发酵15 d以后各处理组间的总酸含量基本稳定，各处理组间差异不显著(P>0.05)。表明，接种乳酸菌发酵苜蓿草，发酵物的pH能快速降到4.2以下并有较高的有机酸积累，同时对酵母和霉菌有很好的抑制作用，有利于提高苜蓿草粉的发酵品质。

2.3 发酵苜蓿的成分分析

随着发酵时间的延长，各组DM含量呈升高趋势，NDF和ADF含量呈降低趋势，CP含量较为平稳(表4)。发酵7和15 d时，LP+EF组DM含量显著高于其它各处理组(P<0.05)；发酵60 d时，与原料组相比，对照组、LP、EF、LP+EF组DM含量分别提高了1.67%、3.51%、4.74%和3.40%(P<0.05)。

7和15 d各时间点各处理组CP含量差异不显著(P>0.05)；发酵60 d时，原料组CP含量(19.93%)显著低于各处理组CP含量(P<0.05)，各试验组之间CP含量差异不显著(P>0.05)。发酵7和15 d时，各处组NDF含量差异显著(P<0.05)；发酵60 d时，原料组ADF含量(34.46%)显著高于其它各处理组(P<0.05)。

2.4 发酵苜蓿在有氧暴露过程中微生物、pH和总酸含量的动态变化

将发酵60 d的苜蓿暴露3和7 d时，对照组和处理组中均未检测到乳酸菌(表5)，只在对照组中检测到酵母菌和霉菌。发酵3 d时，对照组中酵母菌和霉菌数量分别为1.56×104和4.32×104cfu·g-1；发酵7 d时，对照组中酵母菌和霉菌数量分别为2.05×104、10.5×105cfu·g-1。

暴露3和7 d时，对照组pH分别为4.93、5.32，均显著高于其它处理组(P<0.05)；总酸含量方面，暴露3和7 d时，对照组总酸含量分别为14.05、11.52 g·kg-1，均明显低于其它处理组(P<0.05)(表5)。

表5 暴露发酵苜蓿草粉中微生物及有机酸的含量测定结果Table 5 Results of microbe counts and total acid production in alfalfa meal samples fermented under exposure to air

3 讨论

3.1 乳酸菌对苜蓿发酵品质的影响

乳酸菌是一类常用的发酵添加剂，在牧草青贮、饲料原料和中药发酵等领域有着广泛的应用。大量研究表明[15-16]，添加乳酸菌能够提高青贮饲料中乳酸含量、降低pH，减少干物质和蛋白质等的损失，同时乳酸菌在生长繁殖过程中能产生多种酶、维生素和乳酸菌素等有益代谢产物，从而获得优质的青贮饲料。本研究利用乳酸菌发酵苜蓿干草粉，各处理组评分结果均为1级，对照组为2级，表明添加乳酸菌能提高苜蓿干草粉的发酵品质。原因可能是接种的乳酸菌在短时间内大量生长繁殖形成优势菌群，产生的乳酸使底物pH迅速下降，能够抑制丁酸菌、大肠杆菌和酵母菌等有害菌的生长，不良发酵危害减小。对照组在试验结束时，pH尚未达到常规青贮品质评定中低于4.2的标准，其它处理组在发酵7 d时，pH均在4.2左右；总酸含量在发酵15 d时趋于稳定，对照组总酸含量显著低于其它处理组。

3.2 乳酸菌发酵对苜蓿营养成分的影响

优质的发酵饲料不仅要求其较高的发酵品质，同时发酵后也要具备较高的营养价值，以满足畜禽的营养需求。苜蓿干草因其较高的蛋白含量和消化吸收率，使其成为高产奶牛的优质饲料，但在青贮或干草发酵过程中，其自身蛋白酶能使蛋白分解为游离氨基酸和氨态氮等非蛋白氮，造成严重的蛋白损失并降低总氮利用率[17]。NDF和ADF含量是反映纤维品质好坏的最有效的指标，ADF含量与动物的消化率呈负相关，因此通过检测发酵前后NDF和ADF的含量，对发酵苜蓿草营养价值的评定具有重要的参考价值[18]。本研究通过接种乳酸菌发酵苜蓿，发酵完成后LP、EF、LP+EF组与对照组相比，CP、NDF含量差异不显著，ADF明显低于对照组，但各处理之间ADF含量差异不显著。与原料相比，除NDF含量差异不显著外，各组其它指标均明显优于原料。原因可能是发酵过程中产生的有机酸导致pH降低，蛋白酶的活性及有害微生物的不良发酵作用受到抑制，使发酵品质得到提高。

3.3 有氧暴露对发酵产物中微生物、pH和总酸含量动态变化的影响

相关研究表明，有氧暴露时pH的变化能直观地反映出青贮饲料的腐败速度和程度[19]，而未解离的短链脂肪酸进入微生物细胞并释放H+，通过降低细胞内部的pH抑制酵母和霉菌等真菌的生长[20]。对照组暴露7 d后，pH显著升高至5.32，总酸含量降低了约20%；其它处理组pH在有氧暴露阶段上升缓慢且均保持在4.2以下，总酸含量略有下降。在暴露3和7 d时，对照组中均检测到酵母和霉菌的存在，并且数量呈上升趋势，其它处理组在有氧暴露阶段均未检测到，这可能是因为较高有机酸的含量和低pH对酵母和霉菌的生长有抑制作用的缘故。本研究表明，在有氧暴露阶段，与对照组相比，乳酸菌的处理组pH较低、总酸含量较高，有利于提高发酵产物的有氧稳定性。

4 结论

在苜蓿中添加植物乳杆菌、屎肠球菌以及二者的复合菌液，均能改善苜蓿草粉的品质和营养成分组成，增加总酸含量，降低发酵产物pH，增强其氧稳定性。综上所述，单一和复合乳酸菌处理均有益于苜蓿草粉的开发和利用。

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(责任编辑 苟燕妮)

Effects of lactic acid bacteria on fermentation quality of alfalfa meal

Qiao Hong-xing1,2,3, Shi Hong-tao1,2,3, Wang Yong-fen1,Jiang Ya-le4, Bian Chuan-zhou1,2,3

(1.College of Bioengineering, Henan University of Animal Husbandry and Economy, Zhengzhou 450046, China；2.Key Laboratory of Probiotics Fermentation Traditional Chinese Medicine of Zhengzhou City, Zhengzhou 450046, China；3.Probiotics Bioconversion Engineering Technology Research Center of Henan Province, Zhengzhou 450046, China；4.Mengjin Animal Husbandry Bureau of Luoyang City, Luoyang 471100, China)

This study aimed to investigate the effects of lactic acid bacteria on the fermentation quality of alfalfa meal. There were four treatment groups, including a control group treated with sterile water and experimental groups treated with plant-derivedLactobacillusplantarumonly, excrement-derivedEnterococcusfaeciumonly, or both of them together. Alfalfa meal samples were obtained and analysed at several time points. Each group had three replicate samples at each time point. The results showed that, compared with the control group, each treatment group had a good sensory assessment score, and all treatment groups showed an increase in total acid content (P<0.05) and a decrease in the pH of the alfalfa silage after 60 d. The dry matter content was higher in the group treated only withE.faeciumthan in the other groups. There were no significant differences in acid detergent fibre content among the three experimental groups (P>0.05), but all the experimental groups had a lower acid detergent fibre content than the control group. After exposing the samples to air for 7 d, we found that the pH were significantly lower in the experimental groups than in the control group, whereas the opposite pattern was observed for total acid content. Yeast and mould were only observed in the control group. In conclusion, fermentation of alfalfa meal withL.plantarumorE.faeciumhad positive effects on its quality, stability, and chemical composition.

Lactobacillusplantarum;Enterococcusfaecium;Medicagosativa; fermentation; fermentation quality; aerobic stability; component analysis

Bian Chuan-zhou E-mail:chuanzhou-bian@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0477

2016-09-13 接受日期：2017-03-24

河南省自然科学基金项目(162300410128)；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目(2014GGJS-124)；河南牧业经济学院科技创新团队项目(HUAHE2005001)

乔宏兴(1976-)，河南新乡人，副教授，硕士，研究方向为益生菌发酵中药。E-mail:zzmzqhx@163.com

边传周(1966-)，河南商丘人，教授，硕士，研究方向为益生菌发酵中药。E-mail:chuanzhou-bian@126.com

S541+.1;S816.6;Q939.11+7

A

1001-0629(2017)08-1741-07

乔宏兴,史洪涛,王永芬,姜亚乐,边传周.乳酸菌对苜蓿草粉发酵品质的影响.草业科学,2017,34(8)：1741-1747.

Qiao H X,Shi H T,Wang Y F,Jiang Y L,Bian C Z.Effects of lactic acid bacteria on fermentation quality of alfalfa meal.Pratacultural Science，2017,34(8)：1741-1747.

后生物生产层