一种金针菇水提液多糖含量的检测方法

张 剑，弓志青，王文亮，贾凤娟，崔文甲，王月明

（1.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100；2.山东省农产品精深加工技术重点实验室，山东济南250100）

一种金针菇水提液多糖含量的检测方法

张 剑1，2，弓志青1，2，王文亮1，2，贾凤娟1，2，崔文甲1，2，*王月明1，2

（1.山东省农业科学院农产品研究所，山东济南250100；2.山东省农产品精深加工技术重点实验室，山东济南250100）

以金针菇子实体为原料，运用热水浸提的方法提取金针菇多糖，采用苯酚硫酸法及3,5-二硝基水杨酸法分别测定水提液中的总糖及还原糖含量，以总糖和还原糖之差表示多糖含量，并进行方法学考查。结果表明，该方法样品处理简单，具有良好的适应性，其精密度、稳定性、加样回收率均符合要求，可用于金针菇水提液多糖含量的测定。

苯酚硫酸法；3,5-二硝基水杨酸法；金针菇多糖

金针菇（Flammulina velutipes）又名冬菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌，隶属担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）金钱菌属（Flammulina），在自然界分布广泛，中国、日本、俄罗斯和澳大利亚等国均有分布，目前已经发展成为仅次于白蘑菇和香菇的第三大食用菌[1]。金针菇菌盖滑嫩，菌柄细长脆嫩，形美，味鲜，富含蛋白质、多种维生素及钙、铁、磷等矿物质，是世界上著名的食药两用菌和观赏菌。其中，精氨酸和赖氨酸含量丰富，对儿童智力发育有重要作用，因此享有“增智菇”的美称[2]。

金针菇多糖是金针菇主要的活性物质之一，具有抗肿瘤、保肝脏、抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力等多种生理功效。目前，国内外学者对金针菇多糖的研究主要集中在分离纯化、结构及其修饰、生物活性功能、产品开发等方面[3]，金针菇多糖方便快速准确的测定是上述研究工作的基础。目前，常用的多糖含量测定方法有苯酚硫酸法[4-6]、蒽酮硫酸法[7]以及3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）[8]。由于前2种方法无法排除单糖等还原糖的影响，导致测量结果偏高；而DNS法测定多糖时需要水解，很难量化水解是否完全，且操作比较繁杂[9]。将二者相结合则可准确快速地测定多糖含量[10-12]，但用于金针菇多糖的检测尚未见相关报道。试验以金针菇为原料，采用苯酚硫酸法和DNS法分别测定金针菇水提液中的总糖和还原糖含量，二者之差即为多糖含量，并对2种方法进行了方法学考查，旨在建立一种简便、可精确测定金针菇水提液多糖含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金针菇，购于济南华联超市；葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸，国药集团化学试剂有限公司提供；重蒸酚，北京索莱宝科技有限公司提供；硫酸，莱阳经济技术开发区精细化工厂提供；其他试剂均为国产分析纯。

UV-160型紫外分光光度计，日本岛津公司产品；UV6000型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；AR423CN型电子天平，奥豪斯（上海）仪器有限公司产品；LXJ-IIB型高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；DK-8D型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司产品；ZN-20L型小型粉碎机，北京兴时利和科技发展有限公司产品。

1.2 溶液配制

1.2.1 苯酚溶液配制

配制80%的苯酚母液，于4℃冰箱中保存，用于配制6%苯酚溶液。

1.2.2 DNS试剂配制

A液：溶解6.9 g重蒸酚于15.2 mL 10%氢氧化钠中，并稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g亚硫酸氢钠。B液：称取255 g酒石酸钾钠，加到300 mL 10%氢氧化钠中，再加入880 mL 1%DNS溶液。将A液与B液相混合即得黄色试剂，贮藏于棕色试剂瓶中，在室温下放置7 d后过滤使用[13]。

1.3 试验方法

1.3.1 金针菇水提液的制备

将金针菇子实体于60℃烘箱中烘干，粉碎过80目筛。准确称取1.000 g金针菇粉末，按1∶30的料液比加入蒸馏水，于90℃下水浴浸提4 h，取出后以转速8 000 r/min离心20 min去沉淀，取上清液备用。将上清液稀释一定倍数用于总糖含量检测，原液用于还原糖含量检测。

1.3.2 苯酚硫酸法测定总糖标准曲线制作

精确称取烘干至恒质量的葡萄糖粉末0.500 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得到5 mg/mL的溶液，取1 mL上述溶液并稀释定容至50 mL，得到0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，准确吸取质量浓度0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液1，2，3，4，5，6 mL至10 mL容量瓶中定容，依次得到质量浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 mg/mL的溶液，分别向每个反应试管中加入2 mL上述质量浓度的葡萄糖溶液，空白对照管为2 mL蒸馏水，再加入1 mL 6%苯酚，振荡混匀，快速加入5 mL浓硫酸，振荡摇匀，放入沸水浴中15 min，反应完毕后迅速用冷水降温，稳定至室温后于波长490 nm处测吸光度[14]。

1.3.3 DNS法测定还原糖标准曲线制作

精确称取烘干至恒质量的葡萄糖粉末0.100 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，得到1.0 mg/mL的溶液，准确吸取1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.2， 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL分别置于25 mL比色管中，用蒸馏水补充至2.0 mL，空白对照为2.0 mL蒸馏水，各加入2.0 mL DNS试剂，迅速振荡摇匀，沸水浴5 min，冷水冷却至室温，定容至25 mL，静置30 min后于波长520 nm处检测。

1.3.4 多糖含量测定

分别运用苯酚硫酸法、DNS法检测总糖和还原糖的含量，二者之差即为多糖含量，即多糖含量=总糖含量-还原糖含量。

1.3.5 精密度试验

精密吸取总糖及还原糖供试品溶液各6份，分别按1.3.2和1.3.3项中方法操作，测定吸光度，考查苯酚硫酸法、DNS法的精密度。

1.3.6 稳定性试验

精密吸取总糖和还原糖供试品溶液各6份，分别按1.3.2和1.3.3项中方法操作，在0，10，20，30，40，50，60，90 min测定吸光度，考查苯酚硫酸法及DNS法的稳定性。

1.3.7 加样回收率试验

精确吸取总糖含量已知的提取液6份各1 mL，精确加入1 mL 0.04 mg/mL的葡萄糖溶液，按1.3.2项下方法操作，测定吸光度，并计算苯酚硫酸法的加样回收率；精密吸取还原糖含量已知的提取液6份各1 mL，精确加入1 mL 0.5 mg/mL的葡萄糖溶液，按1.3.3项下方法操作，测定吸光度，并计算DNS法的加样回收率。

1.3.8 金针菇水提液多糖含量测定

取6份金针菇水提液，按1.3.2和1.3.3项下方法操作，测定的吸光度带入相应的标准曲线回归方程，计算出总糖及还原糖含量，二者之差为多糖含量。

2 结果与分析

2.1 苯酚硫酸法测定总糖标准曲线

苯酚硫酸法标准曲线见图1。

图1 苯酚硫酸法标准曲线

由图1可知，线性回归方程为Y=0.0156X+0.00329，R2=0.999 8，在0.01～0.06 mg/mL范围内线性良好。

2.2 DNS法测定还原糖标准曲线制作

DNS法标准曲线见图2。

由图2可知，线性回归方程为Y=1.671 6X-0.049，R2=0.999 9，在0.1～0.7 mg/mL范围内线性良好。

2.3 精密度试验

苯酚硫酸法测定总糖精密度试验见表1，DNS法测定还原糖精密度试验见表2。

图2 DNS法标准曲线

表1 苯酚硫酸法测定总糖精密度试验

表2 DNS法测定还原糖精密度试验

由表1和表2可知，苯酚硫酸法测定总糖和DNS法测定还原糖精密度良好。

2.4 稳定性试验

苯酚硫酸法测定总糖稳定性试验见表3，DNS法测定还原糖稳定性试验见表4。

表3 苯酚硫酸法测定总糖稳定性试验

表4 DNS法测定还原糖稳定性试验

由表3和表4可知，苯酚硫酸法测定总糖显色在90 min内较稳定，DNS法测定还原糖显色在90 min内较稳定。

2.5 加样回收率试验

苯酚硫酸法测定总糖加样回收率试验见表5，DNS法测定还原糖加样回收率试验见表6。

由表5和表6可知，苯酚硫酸法测定总糖和DNS法测定还原糖加样回收率较好。

表5 苯酚硫酸法测定总糖加样回收率试验

表6 DNS法测定还原糖加样回收率试验

2.6 金针菇水提液多糖含量测定

金针菇水提液多糖含量测定见表7。

表7 金针菇水提液多糖含量测定

由表7可知，苯酚硫酸法联合DNS法测定金针菇水提液中多糖结果稳定可靠。

3 结论

金针菇多糖含量测定，是多糖研发以及相关产品品质控制的前提。许多研究者采用苯酚硫酸法或者蒽酮硫酸法来测定金针菇多糖含量，而这2种方法测定的含量均高于多糖的实际含量，因为测定的是包括还原糖在内的总糖含量[15]。要精确测定多糖的含量，必须首先去掉还原糖，可以采用透析或者醇沉的方法，这样就增加了试验操作。若直接对水提液进行多糖含量测定可简化试验流程，试验采用苯酚硫酸法联合DNS法检测金针菇水提液中的总糖及还原糖含量，多糖含量为总糖和还原糖含量差值，排除了单糖等还原糖的干扰，测得准确的多糖含量。经过方法学验证，该法比较准确、稳定，适合金针菇水提液多糖含量测定，同时也为其他材料水提液多糖含量的测定提供参考。

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[2]王文亮，徐同成，刘丽娜，等.金针菇的保健功能及其开发前景[J].中国食物与营养，2011，17（7）：18-19.

[3]王卫国，张仟伟，李瑞静，等.金针菇多糖的生理功能及其应用研究进展[J].河南工业大学学报（自然科学版），2016，37（1）：120-128.

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[15]方积年，丁侃.多糖的研究开发中值得注意的一些问题[J].食品与药品，2007，9（12）：1-4.◇

Method for Detecting Polysaccharide in Water Extraction from Flammulina Velutipes

ZHANG Jian1，2，GONG Zhiqing1，2，WANG Wenliang1，2，JIA Fengjuan1，2，CUI Wenjia1，2，*WANG Yueming1，2
（1.Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，SAAS，Ji'nan，Shandong 250100，China；2.Shandong Provincial Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology，Ji'nan，Shandong 250100，China）

Using Flammulina velutipes fruiting body as raw material，the Flammulina velutipes polysaccharide is extracted by hot water.The contents of total sugar and reducing sugar in water extracts are determined by phenol sulfuric acid and 3,5-dinitrosalicylic acid（DNS）method.The concentration of polysaccharide depended on their concentration difference.The methodology is also investigated.The results show above methods are convenient and have good adaptability.The precision，stability and recovery rate of the sample are all in accordance with the requirements.The method can be used for the determination of polysaccharide in water extraction from Flammulina velutipes.

phenol-sulfuric acid method；3,5-dinitrosalicylic acid method；Flammulina velutipes polysaccharide

TS219

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.08.010

1671-9646（2017）08a-0031-04

2017-06-07

山东省农业重大应用技术创新项目“食用菌副产物综合利用技术研究与示范”（20170406）；山东省现代农业产业技术体系食用菌产后加工岗位专家项目（SDAIT-07-08）。

张剑（1984—），女，硕士，研究方向为果蔬加工。

*通讯作者：王月明（1968—），男，硕士，研究员，研究方向为新食品资源加工、植物营养和资源无害化综合利用技术。