东方蝼蛄醇提物对3种人类肝癌细胞株的细胞毒性研究

杨勇琴 张成桂 自加吉 丁小倩 杨泽芳 余 敏 熊 伟,*

1. 大理大学基础医学院，云南 大理 671000；2. 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000；3. 云南大学生命科学学院，云南 昆明 671000

东方蝼蛄醇提物对3种人类肝癌细胞株的细胞毒性研究

杨勇琴1张成桂2自加吉1丁小倩1杨泽芳1余 敏3熊 伟1,2*

1. 大理大学基础医学院，云南 大理 671000；2. 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000；3. 云南大学生命科学学院，云南 昆明 671000

目的：通过东方蝼蛄醇提物对3种人类肝癌细胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)的细胞毒性测试，探讨东方蝼蛄醇提物的体外抗肿瘤活性。方法：采用乙醇冷浸法对东方蝼蛄干燥品粉碎物进行提取，通过聚酰胺柱层析分离划段得到东方蝼蛄醇提物的不同部位，所得部位通过MTT法对3种人类肝癌细胞株进行体外肿瘤细胞毒性测试。结果：东方蝼蛄醇提物中有2个分离组分对人类肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50)值小于10.0 μg/mL，对人类肝癌细胞具有明显的细胞毒性。结论：东方蝼蛄醇提物中存在着对肿瘤细胞体外生长具有抑制作用的物质，值得进一步研究。

东方蝼蛄；醇提物；肝癌细胞；MTT；细胞毒性

东方蝼蛄(Gryllotalpa orientallis Burmeister)为昆虫纲、直翅目、蟋蟀总科、蝼蛄科的昆虫，俗称为拉拉蛄、土狗子、地拉蛄、天蝼[1]。我国蝼蛄资源丰富，已知品种约有50种，如东方蝼蛄、华北蝼蛄、欧洲蝼蛄和台湾蝼蛄等[2]。其中，东方蝼蛄是我国的广布种，也是蝼蛄药材的主要商品品种，它的化学成分主要有氨基酸、微量元素、脂肪酸、甾醇和苯乙酸等[3]。以蝼蛄入药的组方始载于《吕氏春秋》，在历代重要本草典籍中均有收集，各地民间也有广泛的应用。不同种类的蝼蛄间类聚关系较远，对不同地域同一种的蝼蛄类聚关系则较近，根据类聚关系可以采用近红外光谱分析法对蝼蛄种的分类以及蝼蛄药材进行分析和鉴定[4]。蝼蛄及其伪品的水溶液采用高效液相色谱法分析，HPLC图谱显示出不同的指纹特征，可对中药蝼蛄进行品种鉴别[5]。尽管在传统意义上蝼蛄属于害虫，但随着我国对祖国传统中医药资源研究开发的重视，已经陆续有关于蝼蛄药理作用的研究报道[6]。

目前，从中药材中寻找抗肿瘤药物及抗肿瘤药物前体已经成为医药领域广大科研工作者从事的科研方向之一。据此，研究结合已有的文献报道及民间使用情况，对东方蝼蛄醇提物的抗肿瘤活性进行研究。本研究主要通过乙醇对东方蝼蛄干燥品粉碎物进行提取，将醇提物通过聚酰胺柱层析分离划段，得到不同的分离部位样品。进一步采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)对3株人类肝癌细胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)的细胞毒性进行测试，以二甲基亚砜(DMSO)为空白对照，顺铂(DDP)为阳性药物对照，通过活性测试结果比较分析，初步探讨东方蝼蛄醇提物的体外抗肿瘤活性。

1 材料与仪器

1.1 药材 东方蝼蛄购自安徽省亳州市药材市场，由大理大学药学院生药学教研室张德全副教授鉴定为GryllotalpaorientallisBurmeister。如图1所示。

1.2 细胞株 人类肝癌细胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)均购自中国科学院上海细胞库。

1.3 试剂 高糖DMEM培养基(Gibco公司)；胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Gemini公司；顺铂(DDP，山东齐鲁制药厂)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、胰蛋白酶、EDTA 、DPBS购自江苏碧云天生物技术有限公司。乙醇、甲醇、异丁醇等试剂均为国产分析纯。

1.4 仪器 AL204型电子天平(美国梅特勒-托利多仪器有限公司)；ZFJ-30B型中草药粉碎机(江阴市普友粉体设备有限公司)；SHZ-3循环水多用真空泵(上海青浦沪西仪器厂)；RE-5205型旋转蒸发仪(上海亚东生化仪器厂)；COOL SAFE 95-15型冷冻干燥机(北京博医康技术有限公司)；ZW-AZ型微量振荡器(常州国华电器有限公司)；0408-2型台式低速离心机(上海医疗器械集团有限公司手术器械厂)；MCO-18AIC CO2型细胞培养箱(日本Sanyo公司)；Synergy-HT型多功能酶标仪(Bio-Tek公司)；IX-7型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；96孔细胞培养板(美国Corning公司)；ES-315型高压灭菌锅(日本Tomy Kogyo公司)。

2 方法

2.1 东方蝼蛄醇提物的制备 将东方蝼蛄干燥虫体3kg粉碎后，用15倍量95%乙醇冷浸提取3次，所得乙醇合并后浓缩，石油醚脱脂得提取浸膏[7]。制备过程如图2。

2.2 测试样品配制 取20g东方蝼蛄浸膏水溶后，上聚酰胺柱，依次用水及不同比例的含水甲醇洗脱，定量收集，分别浓缩纯化后冷冻干燥，共得到12个部位的样品，编号为GB01～GB12。

2.3 实验样品溶液配制 取样品1mg，先用20 μL DMSO溶解，再用DMEM细胞培养基稀释成质量浓度分别为200.0μg/mL、66.7μg/mL、22.2 μg/mL、7.4μg/mL的样品溶液。

2.4 阳性对照品溶液配制 取质量浓度为1mg/mL的DPP溶液，用DMEM细胞培养基配制成质量浓度分别为10.00μg/mL、3.33μg/mL、1.11μg/mL、0.37μg/mL的对照品溶液。

2.5 改良MTT法测试受试物对人类肝癌细胞的细胞毒性 将3种人肝癌细胞株(HepG2、BEL7402、SMMC7721)分别置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，在37℃、5%CO2的培养箱中进行培养，取对数生长期的细胞进行实验。细胞计数后调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，培养24h；分别在每孔中加入样品溶液50μL，每个浓度至少设3个复孔，同时作阴性对照(DMSO)和阳性对照(DPP)，再培养 72h后，每孔加入10μL的MTT液(5mg/μL)，再置培养箱中继续孵育4h，沿孔边缘轻轻吸去每孔中的培养液；分别在每孔加入150μL 三联液(10%SDS～5%异丁醇-0.012mol/L HCl)，置37℃、5%CO2的培养箱中继续培养12h，在检测波长为570nm，参比波长为630nm条件下，测定各孔的吸光度值，每组实验重复4次。细胞抑制率(%)=(1-对照组平均A570值/实验组平均A570值)×100%。细胞的半数抑制浓度(IC50)值由SigmaPlot 13.0软件计算得到。

3 结果与分析

试验结果表明，东方蝼蛄醇提物用聚酰胺层析分离划段所得的12个部位中，除编号为GB01～GB03及GB12的样品对3种人类肝癌细胞株均无抑制作用外，GB04～GB11样品至少对1种人类肝癌细胞株表现出细胞毒性；GB05～GB08样品对3种人类肝癌细胞株都表现出较强的细胞毒活性(表1)。从同一个部位对不同人类肝癌细胞株的细胞毒活性来看，其抗肿瘤活性存在着差异，表明活性部位对不同肿瘤细胞的抑制(或杀灭)作用具有一定的选择性。但从总体而言，所有具有细胞毒活性的分离部位对HepG2细胞的细胞毒活性都强于BEL7402细胞和SMMC7721细胞；与阳性药物顺铂相比，其中高活性部位(如GB07和GB08)的IC50值已达到阳性药物的35%，具有较理想的细胞毒活性。

表1 东方蝼蛄醇提物GB01～GB12样品对所测试3种人类肝癌细胞株的IC50值

表中数据为4次重复实验的平均值；“-”表示IC50>100 mg/L或无抑制作用，表中未列出具体数据。

4 讨论

蝼蛄是农业害虫，能大量啃食植物根部，造成其大片萎蔫，直至死亡。我国蝼蛄资源丰富，以其入药的组方在多种医药典籍中均有记载，各地民间也有广泛的应用[8-10]。欧洲蝼蛄的提取物被用于治疗伤口和烧伤，而东方蝼蛄的提取物被用于治疗脓肿和溃疡[11]。张颂等[12]研究表明，给小鼠饲喂蝼蛄粉5 g /d，连续1个月；家兔0.5 g /( kg·d) ，连续2个月，均未见毒性反应。小鼠发育正常，雌鼠正常怀孕，幼鼠发育良好。家兔体重、白细胞计数、血红蛋白含量测定、尿蛋白及沉淀检查均未发现异常。Ahn等[13]通过染料吸收法研究蝼蛄提取物对人类子宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性，结果表明蝼蛄提取物具有较强的L-氨基酸氧化酶活性，且对HeLa细胞具有较强的细胞毒性。笔者前期的实验研究表明，东方蝼蛄提取物对实验动物具有明显的利尿作用和一定的镇静作用[14]。张普照等[15]研究表明，蝼蛄提取物对金黄色葡萄球菌和结核杆菌具有较明显的抑菌活性。

目前，关于蝼蛄提取物抗肿瘤活性的研究报道并不多见。杨义芳等[16]使用蝼蛄不同极性提取部位对小鼠的实体瘤进行筛选，药效筛选结果表明，以乙醇提取后的石油醚部位的药效最为明显，经有效成分富集的提取物对人类肝癌QGY细胞、肠癌LOVO细胞、肺癌A549细胞和小鼠S180细胞、肝癌H22细胞、肺癌Lewis细胞均有明显的抗肿瘤作用，量效关系明显。魏道智等[17]分析和测定了东方蝼蛄的化学成分，通过体外试验表明，东方蝼蛄提取物对人体的癌细胞具有细胞毒性，但未对其有效部位、有效剂量进行深入的研究。本研究采用乙醇冷浸法对东方蝼蛄干燥品粉碎物进行提取，通过聚酰胺柱层析分离划段得到东方蝼蛄醇提物的不同部位，共获得12个样品。研究发现，东方蝼蛄醇提物不同活性部位的抗肿瘤活性存在着一定的差异。

MTT法又称MTT比色法，是20世纪80年代发展起来的一种快速、简便的体外抗肿瘤药物的细胞毒性测试方法，目前已被广泛用于抗肿瘤药物体外活性筛选试验。MTT法的检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。一般来说，中药抗肿瘤部位活性测试IC50值小于10.0 μg/mL时就值得进一步研究[18]。据此可见，东方蝼蛄提取物中确实存在具有肿瘤细胞生长抑制(或杀灭)作用的活性物质。

近年来与蝼蛄相关的各项药学研究逐渐成为热点。但是，蝼蛄有些化学成分尚不明确，药理与体内作用机制及临床应用的研究也需深入研究。此外，蝼蛄是一种昆虫类药材，其毒副作用的研究也应予以重视。可以预见的是，随着各方面研究水平的不断提高，蝼蛄很有可能成为一种极具前途、应用更加广泛的昆虫类中药材。

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投稿注意

作者署名：作者姓名在文题下按序排列，作者单位名称及邮政编码列在作者姓名后面。如多位作者之间用“，”隔开，不同工作单位的作者，应在姓名右上角加注不同的阿拉伯数字序号，并在其工作单位名称之前加与作者姓名序号相同的数字，各工作单位之间连排时以分号“；”分开。通信作者一般只列1位，由投稿者确定。

Study on Human Liver Cancer Cells Cytotoxicity of Ethanol Extracts of G. orientallis Burmeister

YANG Yongqin1ZHANG Chenggui2ZI Jiaji1DING Xiaoqian1YANG Zefang1YU Min3XIONG Wei1,2*

1. Pre-clinical College, Dali University, Dali 671000, China;2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali 671000, China;3. School of Life Sciences,Yunnan University, Kunming 650091, China

Objective To study the in vitro anti-tumor activity of ethanol extracts from G. orientallis Burmeister by cytotoxicity assay on three liver cancer cells(HepG2、BEL7402、SMMC7721). Methods Extracts of G. orientallis Burmeister are prepared by ethanol cold-maceration method. The samples are prepared with polyamide column chromatography separation of extracts of G. orientallis Burmeister and the cytotoxicity of samples with MTT assaying. Results There are 2 samples have strong cytotoxicity and some of them have IC50 lower than 10.0 μg/mL. There are anti-tumor activity compouds in extracts of G. orientallis Burmeister by comparison the cell cytotoxicity results. Conclusion Extracts of G. orientallis Burmeister inhibit the growth of human liver cancer cells in vitro and it merits further research.

G. orientallis Burmeister；Extracts；Liver Cancer Cell；MTT；Cytotoxicity

云南省昆虫生物医药研发重点实验室开放课题(201617)；云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目(第十九批)。

杨勇琴，女，硕士研究生，讲师，研究方向为昆虫生物医药的开发与研究。E-mail:yangyongqin1979@163.com

熊伟，男，博士研究生，副教授，硕士生导师，研究方向为肿瘤细胞分子生物学。E-mail: xwailp@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)15-0066-04

2017-04-22 编辑：陶希睿)