铁皮石斛非传统药用部位叶中多糖及5种重金属含量的测定

符德欢 王 丽 蒲星宇

云南省药物研究所/云南白药集团创新研发中心/云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111

铁皮石斛非传统药用部位叶中多糖及5种重金属含量的测定

符德欢 王 丽 蒲星宇

云南省药物研究所/云南白药集团创新研发中心/云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南 昆明 650111

目的：测定铁皮石斛叶中多糖及5种重金属元素的含量，了解铁皮石斛叶中多糖及重金属含量情况，为更深入研究开发铁皮石斛叶提供实验依据。方法：采用微波消解法进行样品前处理；电感耦合等离子体质谱法测定5种重金属元素的含量；紫外分光光度法测定多糖的含量。结果：9个铁皮石斛叶样品中的多糖含量在9%～19%之间；铁皮石斛叶对重金属元素具有一定的蓄积作用，除1号、8号和9号样品符合限量标准外，其余6个样品均超标。结论：铁皮石斛叶中含有一定量的多糖，对拓宽铁皮石斛的药材来源具有重要的参考价值，但部分样品中重金属含量超标，在进一步开发利用铁皮石斛叶时，应重视重金属元素含量的控制。

铁皮石斛叶；多糖；重金属；含量测定

铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo是兰科石斛属植物，收载于2015年版《中华人民共和国药典》一部[1]。主产于贵州、云南和广西。本品始载于《神农本草经》，列为上品，具有益胃生津、滋阴清热的功效。近年来发现多糖能够治疗免疫系统受损而引发的一些疾病，是一类具有很大开发潜力的免疫调节剂[2]。目前，关于铁皮石斛茎中的多糖已有很多研究报道，但对铁皮石斛叶中多糖的研究少见。

目前，国际上对于药材中的有毒重金属含量限制极为严格，中药材中重金属含量超标的事件时有报道，其重金属含量的高低直接影响到药材的质量[3]。笔者对非传统药用部位铁皮石斛的叶中多糖及5种重金属含量展开研究，以便在综合开发利用铁皮石斛叶时，提供基础数据指导。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Speedwave 4微波消解系统(Berghof，Inc.德国)；7700X电感耦合等离子体质谱仪(7700X ICP-MS，美国Agilent 公司)；101A-2E型鼓风干燥箱(上海安亭科学仪器厂)，TYS-500A型高速多功能粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司)；聚四氟乙烯罐；FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；UV-2501PC紫外分光光度计(SHIMADZU，日本)；ML-3-4可调式电热板(北京市永光明医疗仪器厂)；移液枪(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；Milli-Q超纯水发生器(ADVANTAG A10，美国密理博公司)。

1.2 试剂 铜、镉、铅、砷、汞标准溶液，硝酸(优级纯)，盐酸(优级纯)，D-无水多糖(批号：110833-201205，中国食品药品检定研究院)、苯酚(汕头市光华化学厂)、无水硫酸(批号：20111101，重庆川东化工集团有限公司)、无水乙醇(批号:0910073301，安徽安特生物化学有限公司)

1.3 药材的采集 1～7号样品采集于家种铁皮石斛的新鲜叶片，8号样品采集于普洱野生铁皮石斛的新鲜叶片，9号样品采集于文山野生铁皮石斛的新鲜叶片，原植物均经云南省药物研究所鉴定，为兰科石斛属植物铁皮石斛DendrobiunofficinaleKimura et Migo。

1.4 药材折干率 将刚刚采摘的新鲜叶片分别进行称重，记下各自重量(鲜重)，再将叶片放于鼓风干燥箱中(60℃)烘烤干后再进行称重，记下各自重量(干重)。结果见表1。

表1 铁皮石斛叶折干率

2 方法与结果

2.1 多糖的测定2.1.1 实验方法 按照《中国药典》2015年版一部，铁皮石斛含量测定项下多糖检测的方法[1]。照紫外-可见光分光光度法(通则0401)测定吸光度。

2.1.2 对照品溶液的制备 取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加超纯水稀释为每1mL含90μg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 分别取9种样品的粉末(过3号筛)约0.3g，精密称定后，加超纯水200mL加热回流2h，放冷，转移至250mL容量瓶，加少量超纯水分次洗涤容器，洗液并入同一容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取溶液2mL，至15mL离心管中，精密加无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心(转速为4000r/min)20min，弃去上清液，沉淀加80%的乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液。沉淀加热水溶解，转移至25mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验 测定10次标准品溶液的吸光度，计算RSD值为2.3%，仪器满足样品检测要求。

2.1.4.2 重复性及稳定性试验 取8号样品6份，按照样品处理方法处理后，测定样品吸光度，结果RSD均小于5%。将处理好的样品放置2、4、8、12、24h后分别进行测定，各元素的含量变化较小，RSD均小于5%。2.1.4.3 加样回收率试验 精密称取已知无水葡萄糖含量的8号样品9份，每3份分别按照含量的80%、100%、120%精密加入无水葡萄糖对照品，照样品测定项下方法测定，计算回收率。结果无水葡萄糖的平均回收率为97.85%，RSD为1.23%。其结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.1.5 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置10mL具塞试管中，加水补至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，再精密加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版四部通则0401)，在488nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。见表3。

表3 铁皮石斛回归方程、相关系数

2.1.6 样品的测定 精密量取供试品溶液1mL，置10mL具塞试管中，精密加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，再精密加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在488nm波长处测定吸光度，依照吸光度，从标准曲线上读出无水葡萄糖的量，计算，即得。1～9号铁皮石斛叶中均含有多糖，含量介于9%～19%之间，野生铁皮石斛8号、9号的多糖含量高于家种铁皮石斛1～7号的多糖含量。见表4。

表4 铁皮石斛叶多糖含量

2.2 重金属元素的测定条件

2.2.1 标准溶液的制备2.2.1.1 内标溶液的制备 分别取浓度为1.000g/L含Ge、In、Bi的内标溶液100μL于100mL的容量瓶中，用2%的硝酸定容至100mL，作为内标溶液，浓度即为10ug/L。

2.2.1.2 混合标准溶液的制备 分别取一定量的Cu、Cd、Pb、As、Hg5个梯度标准溶液，分别置于5个容量瓶中，用10%的硝酸定容至刻度。配制的标准溶液浓度见表5。

表5 标准溶液浓度

2.2.2 供试品溶液的制备 分别取不同产地的铁皮石斛叶制备为细粉，分别取药材细粉0.3g，精密称定，置聚四氟乙烯消解罐内，加硝酸7.5 mL，混匀，浸泡过夜，盖好内盖和防爆膜，旋紧外套，置微波消解系统内，进行消解(按表6微波消解程序操作)。消解完全后，取出消解罐，冷却至室温，将消解罐内的液体转移至三角瓶中，用适量去离子水清洗消解罐，清洗液倒入三角瓶中，再将三角瓶放置于电热板上加热至红棕色蒸气挥尽，放冷，用去离子水转入50 mL的容量瓶中，并稀释至刻度，在分别向其中加入200uL金元素，摇匀，放置过夜，并离心(4000r/min)即得。同法制备样品空白试液。

表6 微波消解程序

2.2.3 标准曲线的绘制 以标准溶液测得的吸收值为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算回归方程，在所配置浓度范围内呈良好的线性关系，各元素回归方程、相关系数、线性范围见表7。

表7 回归方程及相关系数 (n=3)

2.2.4 实验结果 经测定，供试品中所含砷(As)、镉(Cd)、铜(Cu)、铅(Pb)和汞(Hg)含量见表8。

表8 5种元素含量结果

根据《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》(2004)对重金属的限量指标： Hg≤0.2 mg/kg，Cd≤0.3 mg/kg，As≤2.0 mg/kg，Pb≤5.0 mg/kg，Cu≤20 mg/kg，检测结果表明：除1号、8号、9号样品符合限量标准外，其余6个样品均超出了限量标准，其中Pb均超标，3号、5号、6号、7号样品中铜超标，3号样品中镉略高于标准。

3 讨论

现代社会人们越来越重视疾病的提前预防，而增加机体自身的免疫力是更为科学的选择。研究表明：多糖具有增加机体免疫力的功效，在应用中也被反复验证。其中铁皮石斛的主要药用成分即为多糖，但传统使用的是茎，叶常被丢弃。通过本实验研究发现，铁皮石斛叶中含有9%～19%不等的多糖，为拓宽铁皮石斛的药用来源提供了重要的参考资料。但部分样品中重金属含量超标，在进一步开发利用铁皮石斛叶时，应重视重金属元素含量的控制。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [M].北京：中国医药科技出版社，2015：282-283.

[2]刘吉成，牛英才.多糖药物学[M].北京：人民卫生出版社，2008：7.

[3]王丽，符德欢. 三七重金属含量影响因素的初步研究[J] .云南中医学院学报，2014，37(5)：13-15.

The Determination of Polysaccharide and 5 Kinds of Heavy Metals In The Non-traditional Medicinal Parts of TheDendrobiumOfficinaleLeaf

FU Dehuan WANG Li PU Xingyu

Yunnan institute of Materia Medica/Yunnan Bai Yao Group Innovation and R&D Center Yunnan Province Company/Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation,Kunming 650111, China

Objective Determination of polysaccharides indendrobiumofficinaleleaf and 5 kinds of heavy metal element content, understand the tin polysaccharides and heavy metal content in the leaves and stems of dendrobium stem situation, for the further research and development provides the theory basis for tinDendrobiumofficinalestem leaves. Methods Before the sample was processed by microwave dissolving method. Inductively coupled plasma mass spectrometry to determine the content of five heavy metal elements; Ultraviolet spectrophotometry measures the content of polysaccharides. Results The amount of polysaccharides in the samples of the nine tin dendrobium leaf were between 9% and 19%. TheDendrobiumofficinaleleaf has a certain cumulative effect on heavy metal elements, except for the 1、8 and 9 samples, the other 6 samples are above the standard. Conclusion This study found that theDendrobiumofficinaleleaf contains a certain amount of polysaccharide, to broaden the tin herbs caulis dendrobii source has an important reference value, but the heavy metal content in some samples, in the further development and utilization ofDendrobiumofficinaleleaf at the same time, should pay attention to control of heavy metal element content.

DendrobiumofficinaleLeaf; Polysaccharide; Heavy Metals;Content Determination

云南省技术创新人才培养计划项目(2014HB069)。

符德欢(1976-)，男，高级工程师，研究方向为民族药、中药资源研究。E-mail：fudehuan@126.com

R284.1

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1007-8517(2017)16-0017-04

2017-06-15 编辑：邓佳丽)