动物模型在抗结核新药药效学评价中的应用

李媛媛 陆宇

·综述·

动物模型在抗结核新药药效学评价中的应用

李媛媛 陆宇

在当前全球结核病防治形势依然严峻、传统抗结核药物对耐药结核病治疗作用有限的情况下，抗结核新药的发现成为迫切关注的问题。而动物模型对药效学的评价是新药研发的关键步骤,是抗结核新药临床应用的有力支持。作者主要从动物模型的种类、特点等方面介绍常见动物模型在新型抗结核药物药效学评价中的应用，进一步加深基础工作研究者对各种动物模型的了解，有利于选择及建立合适的动物模型以满足研究的需求。

结核; 抗结核药; 动物模型; 药物评价; 临床前药代动力学； 综述

当前结核病仍是一个重要的全球性健康问题，而我国更是结核病大国，WHO估算2015年我国新发肺结核患者91.8万例，仅次于印度和印度尼西亚，位列全球第三[1]。面对全球结核病严峻的防治形势，传统抗结核药物已不能满足需要，新型抗结核药物的发现已成为迫切关注的问题。在新型抗结核药物研发过程中，临床前试验可以降低治疗风险和减少经济成本，而动物模型可以通过严格控制实验的条件、增强实验材料的可比性、简化实验操作和样品收集，避免进行人体实验时所带来的风险，有助于更全面地认识疾病的本质，更好地了解药物的药代动力学和药效动力学，以及研究疾病的病理过程，所以在新型药物评价方面具有重要作用。笔者对动物模型在新型抗结核药物药效学筛选与评价中的应用进行综述，为更好地建立新模型与新型药物药效学评价提供帮助。

一、动物模型的种类、特点及应用范围

目前，已成功建立的哺乳动物感染结核分枝杆菌模型包括鼠、豚鼠、兔、牛、羊，及非人类灵长类动物；无脊椎动物感染结核分枝杆菌模型包括阿米巴虫、果蝇和斑马鱼。其中鼠和斑马鱼因其体型小，占用空间少，饲养费用较低，可作为高效益动物模型进行相关研究；而豚鼠由于结核分枝杆菌感染后的病变情况与人类相似，特别是肺部坏死灶，淋巴结结核和结核病的播散情况，所以可用豚鼠模型评估疫苗的效力，可作为疫苗效力检测的金标准；而在斑马鱼的研究中，仅使用成体斑马鱼和胚胎斑马鱼，未见单独分离细胞进行体外实验的研究，故缺少细胞系研究。每一种动物模型都有其不同的特点及应用范围，详见表1。

二、 动物模型在抗结核药物药效学评价中的应用

目前，已成功建立了多种动物结核分枝杆菌感染模型，由于动物自身特点的限制，并不是所有的动物模型都适用于抗结核药物疗效的评价。不同的动物种类、不同感染的分枝杆菌可评价不同的药物类别，且评定药物疗效的指标也不同。例如，非脊椎动物主要感染海洋分枝杆菌，主要通过荧光显微镜检测；鼠和兔等哺乳类动物模型主要通过菌落计数来判定疗效；而非人灵长类动物不仅可以菌落计数，还可以结合氟代脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层扫描(FDG-PET-CT)显像技术评定药物效力。在抗结核药物的药效学评价中常应用的动物模型如下。

表1 动物模型的种类、特点及应用情况

(一)小鼠结核感染模型

在抗结核药物疗效评估的试验中常用BALB/c和C57BL/6鼠系建立小鼠结核感染模型。Tasneen等[2]使用BALB/c小鼠结核感染模型对贝达喹啉(bedaquilin，Bdq，商品名斯耐瑞，曾称TMC-207，也曾称R207910)、利奈唑胺(Lzd)、吡嗪酰胺(PZA)、Pretomanid(PMD，既往曾称Pa-824，具有新型抗结核分枝杆菌活性的抗生素)和Sutezolid(SZD，噁唑烷酮类抗菌药物)的不同用药方案进行疗效评估。对照组小鼠以灌胃方式服用利福平(RFP；10 mg/kg)+异烟肼(INH；10 mg/kg)+PZA(150 mg/kg)2个月，然后再服用RFP+INH(计量同上)2个月，共4个月的疗程；实验组小鼠以灌胃方式服用Bdq+PMD+SZD(3种药物给药量均为50 mg/kg)共4个月的疗程。两组小鼠感染后治疗开始未给药时肺部活菌初始对数值为(6.17±0.27)菌落形成单位(CFU)(根据实践经验小鼠脏器细菌分离数对数值通常>6 CFU)。治疗1个月后对照组肺部活菌为(3.47±0.37) CFU，实验组为(0.94±0.14) CFU；治疗2个月后对照组为(1.59±0.25) CFU，实验组为(0.00±0.00) CFU；治疗4个月后实验组无结果，可能是因为治疗2个月后CFU计数即为0，所以未计数后2个月的活菌对数值，而对照组治疗3个月后为(0.50±0.51) CFU。结果表明，实验组使用的治疗方案灭菌效果明显优于对照组，但因为BABL/c鼠感染结核分枝杆菌后不产生干酪样病变，大部分的结核分枝杆菌主要聚集在细胞内，其形成的病理改变与人类不同，而人类感染的结核分枝杆菌主要分布于干酪样坏死病灶处[2]，而且人类坏死灶形成的肉芽肿微环境也会对药物效力产生负面影响，故使用该结核感染模型具有一定的限制性。

但一些研究发现，C3HeB/FeJ鼠在感染结核分枝杆菌后形成了坏死性肉芽肿[3-4]，这一种系的小鼠与人类病变更为相似，更有利于结核病的病因机制、药效学评价等的研究。Irwin等[5]使用C3HeB/FeJ鼠和BABL/c鼠构建了鼠感染结核分枝杆菌埃德曼菌株的结核模型，并分别对Bdq、PZA单独和联合使用的疗效进行了评估。病变部位药代动力学分析结果显示，PZA穿透力在这两种小鼠中是相同的，对于BABL/c鼠无论单用或合用药物，其肺部菌落计数均明显下降，但C3HeB/FeJ鼠由于肺脏形成了pH值为7.5的坏死性肉芽肿微环境，而PZA在此pH值范围内基本上是不产生药效的，故出现C3HeB/FeJ鼠对药物不敏感的情况，呈现双峰的结果，即部分鼠对药物敏感、部分对药物不敏感，但也进一步验证了并不是因为细菌产生的耐药性而对结果造成影响。因为治疗4周后，Bdq耐药突变不足1%。但研究也发现C3HeB/FeJ鼠在脾脏不形成结核坏死灶，其对药物的反应与BABL/c鼠一样，均是敏感的。以上研究表明，坏死灶的形成确实对药物的作用产生了影响，而这些影响因素可以在临床试验中进一步探索研究。

(二)豚鼠感染结核模型

豚鼠模型是最早建立的分枝杆菌感染动物模型，在19世纪80年代由Robert Koch建立并使用[6]。在动物模型中，认为豚鼠模型的敏感度较高，非常低剂量的实验室菌株的菌浓度(肺中2～3个活菌即可存留与复制)即可建模[7]。但对临床菌株的研究发现，豚鼠模型在使用临床菌株时即使肺部有严重坏死灶也可存活一段时间,故认为对临床菌株的研究可能小鼠模型更适合[8]。

2011年郑梅琴等[9]通过气溶胶感染途径构建了豚鼠结核感染模型，并对INH、莫西沙星、氯法齐明、JYS-1、JYS-2进行了药效学评价。研究发现，治疗组中INH和莫西沙星对肺部病变的恢复和肺脏、脾脏荷菌量的降低明显优于非治疗组。2015年Horváti等[10]利用豚鼠结核感染模型对抗结核新药乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA-pT82)进行了体内药物毒性和药物疗效评估的实验。在评估药物毒性的试验中，豚鼠体质量稳定增长，未出现与药物毒性相关的症状，尸检后的组织也未见明显异常。表明PLGA-pT820对豚鼠未发现明显的药物毒性作用。在评估PLGA-pT82药物疗效的试验中，豚鼠通过肌内注射结核分枝杆菌标准株H37Rv悬液而发生结核感染，结果显示治疗组的豚鼠体质量稳步增长，无死亡情况，组织匀浆菌落计数为“0”；而对照组3只死亡，余下的3只组织匀浆培养后也都发现有结核分枝杆菌生长。

上述研究可知，建立豚鼠结核感染模型有多种方式，既可以气溶胶，也可以肌内注射菌悬液。构建的豚鼠结核感染模型不仅可用于评估传统抗结核药物的疗效，还可用于新型抗结核药物的效力和毒力的评估，这对促进新药研发具有重要作用。

(三)兔结核感染模型

兔结核感染模型常用于结核病发病机制和脊柱结核的研究[11]。但由于其在结核病的研究中并不是主要使用的模型，故这类研究较少。国外的一项研究中使用18F-氟代脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层扫描显像技术动态观察兔结核感染模型的病变情况，通过该技术反映结核病灶荷菌量的改变，发现使用INH或RFP治疗1周后结核病灶的荷菌量明显减少[12]。我国尚博等[13]通过椎体钻孔植入结核分枝杆菌的方法建立了兔脊柱结核模型，同时证明了利福平-壳聚糖(CS)-海藻酸钙(CA)纳米缓释微球的控释化疗可增加椎旁局部药物浓度，有效抑制结核分枝杆菌生长。进一步说明，兔结核感染模型不仅可以用于传统抗结核药物的疗效评估，还可用于探索新的治疗方案。

(四)非人灵长类结核感染模型

Capuano等[14]发现低剂量结核感染食蟹猕猴似乎可代表完整的人结核分枝杆菌感染频谱，对于研究这类传染病的病理与免疫是一个很好的模型。研究中食蟹猕猴感染后大多数在2～8周可见右肺特征性的肺结核结节，在感染8个月后可见空洞，但有的在感染2个月后胸片仍为阴性结果。另外，由于人与动物间存在种属差异，而非人灵长类与人的亲缘关系最近，使得这一模型还可用于潜伏性结核感染的研究，可更好地模拟人类疾病。

2013年Lin等[15]通过2-脱氧-2-18F-氟代脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层显像技术观察了食蟹猴结核感染的疾病过程，并对4种常用的抗结核药物(INH、RFP、PZA、乙胺丁醇)单用和联用的治疗效果进行了评估。研究发现，在疾病进展时期动物肺部肉芽肿的大小和代谢是动态变化的，提示活动性肺结核病变具有高度动态性的特征，而有效的抗结核药物治疗可使肺部结核分枝杆菌的代谢活性降低，并可通过测定氟代脱氧葡萄糖的摄取量进行评估。研究还发现，采用INH治疗后会使个体结核病灶的代谢活性暂时升高，而RFP治疗后结核病灶的代谢活性多为下降；4种药物联合使用可使氟代脱氧葡萄糖的摄取量明显下降，说明联合用药疗效显著。

研究表明，正电子发射计算机断层成像技术可用于新型药物或新治疗方案的早期疗效评估，并可将其直接转化成人类临床试验模型，可主要用于疫苗的评价和免疫学方面的研究，在评价药物疗效方面的应用较少[16-17]。

(五)斑马鱼结核感染模型

斑马鱼因体积小、产量大，饲养相对简单、经济，适合药物和基因突变的大量筛选试验[17]。Takaki等[18]通过尾静脉注射表达荧光蛋白的感染海洋分枝杆菌建立模型，使用荧光测量仪测定斑马鱼体内结核分枝杆菌的含量，可直接客观评价药物的效力、毒力和药物疗效；而之前不能进行斑马鱼肺部活菌计数，只能通过计算其胚胎的死亡率间接评估药物疗效。在斑马鱼结核感染模型中，通过给药后监测荧光菌株的活动，发现巨噬细胞和肉芽肿样病灶在诱导和播散耐药结核病中起到了重要作用。巨噬细胞的氧化应激可诱导细菌外排泵的表达，有利于结核分枝杆菌的复制。有研究表明，在抗结核药物中加入结核分枝杆菌的外排泵抑制剂，例如维拉帕米，可减少巨噬细胞诱导的耐药并可能缩短疗程[19]。

(六)果蝇结核感染模型

Oh等[20]通过腹腔注射海洋分枝杆菌的方式建立了果蝇结核感染模型。研究发现，INH、RFP可有效延长感染果蝇的生存期。随后他们又建立了感染脓肿分枝杆菌的果蝇模型，并评价了替加环素、克拉霉素、Lzd等药物的疗效，发现替加环素的疗效最好[21]。以上研究利用绿色荧光蛋白进行荧光成像，可实时监测果蝇感染和治疗的生存情况，从而快速进行抗结核药物的疗效评价。但感染不同的分枝杆菌，其药物疗效的评价也会有所不同，例如脓肿分枝杆菌对包括INH、RFP在内的一线抗结核药物具有抗药性，但体外试验中其对阿米卡星、克拉霉素等是易感的[22]。因此，应根据待评价的抗结核药物和动物模型的种类，选择合适的菌株感染动物。

三、小动物活体成像技术的应用

传统动物实验需在不同的时间点处死动物以获得多个时间点的实验结果，需要动物数量比较多。而小动物活体成像技术通过对同一实验对象的不同时间点的记录、跟踪，可实时动态观察病理改变、降低个体差异影响，更便捷地评估药物效力，所得的数据也更加真实可信，同时也减少了对动物数量的需求。

生物发光实验是在三磷酸腺苷(ATP)，镁离子(Mg2+)和氧气的参与下，注射底物荧光素与表达的荧光素酶反应产生生物发光的光子，其特异性强，信噪比高，故适用于小动物活体成像。从哈维弧菌得到的细菌荧光素酶基因(LuxAB)插入分枝杆菌中将使发光更亮，使用的底物价格更低而受到广泛关注。体外研究发现，使用LuxAB操纵子进行实验，3 d 就可得到最佳结果，研究中其最低抑菌浓度(MIC)变化与传统方法相比，差异不超过1倍MIC浓度的药物稀释浓度(实验结果加减1～2倍MIC浓度视为可接受范围)，所以结果可靠，并且不需要加入底物。而萤火虫荧光素酶可将体内血红蛋白吸收作用降到最低，产生的光的波长范围可使更多的光通过组织和皮肤而被检测，比细菌表达的荧光素酶更适合进行体内成像[23]。由于生物发光试验在体内检测有着较高的敏感度，常被用于靶向药物递送的观测，包括在鼠模型上评估药物的分布和药物效力[24]。Andreu等[25]运用生物发光成像技术检测了可表达荧光的结核分枝杆菌在其感染小鼠使用INH治疗前后的成像情况。小鼠鼻内感染结核分枝杆菌，感染19 d后以灌胃方式给药(INH：25 mg·kg-1·d-1)。研究显示RFP治疗4 d后，成像的荧光亮度即有减少；治疗10 d后，荧光值减少了8.8倍。治疗前后脏器标本研磨后CFU计数结果与荧光结果一致。运用改进的无创小鼠活体成像生物发光试验检测结核分枝杆菌菌株，可以动态观察急性感染的进展，快速了解和量化抗结核药物的作用。

四、结语

没有一种动物模型能够完全复制人类疾病发生的真实情况及该疾病进展的所有阶段，不可能完全概括结核病病理学的各个方面。动物毕竟不是人体的缩影，模型实验只是一种间接性研究，只可能在一个局部或几个方面与人类疾病相似。因此，模型实验结论的正确性只是相对的，最终必须在人体上得到验证。了解结核病的发病机制，及每种动物模型的特点和优缺点，提高对分枝杆菌感染的免疫应答和宿主与病原体相互作用的认识，有利于选择最合适的动物模型(或它们的组合)，进而利用新技术开发新的动物模型，以更好地满足研究的需要。在抗结核新药药效学评价时，也需要在多种动物模型中进行验证，在药效学评价的不同阶段，文中所列举的动物模型均可应用，但需要根据实验的研究目的和所评价药物的特点进行恰当的选择。

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(本文编辑：孟莉 薛爱华)

The applications of animal models in the new anti-tuberculosis drugs evaluation

LIYuan-yuan,LUYu.

BeijingKeyLaboratoryofDrugResistanceTuberculosisResearch,DepartmentofPharmacology,BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

Correspondingauthor:LUYu,Email：luyu4876@hotmail.com

The global situation of tuberculosis prevention and control is still grim, and the efficacy of conventional anti-tuberculosis drugs for the treatment of drug-resistant tuberculosis is limited. In these cases, it is an urgent concern to discover new anti-tuberculosis drugs. The use of animal models for the pharmacodynamic evaluation is a key step in the new drug research and development and is a powerful support of anti-tuberculosis drugs for clinical application. In order to deepen the understanding of a variety of animal models of the basic researchers, the author introduces the common animal models in the application of pharmacodynamic evaluation of new anti-tuberculosis drugs from the types and characteristics of animal models. It is helpful to select and establish a suitable animal model to meet the needs of research.

Tuberculosis; Anti-tuberculosis drugs; Animal models; Drug evaluation; Preclinical pharmacokinetics； Review

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.09.022

“十二五”国家科技重大专项(2015ZX09102007-015)

101149 首都医科大学附属北京胸科医院 耐药结核病研究北京市重点实验室 北京市结核病胸部肿瘤研究所药物研究室

陆宇，Email：luyu4876@hotmail.com

2017-03-06)