大孔吸附树脂法与高速逆流色谱法分离纯化虎杖中白藜芦醇的比较研究

程丽英，任红涛，刘树兴

(1.郑州工程技术学院 化工食品学院，郑州 450044；2.河南农业大学 食品科学技术学院，郑州 450002；3.陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

大孔吸附树脂法与高速逆流色谱法分离纯化虎杖中白藜芦醇的比较研究

程丽英1，任红涛2，刘树兴3

(1.郑州工程技术学院 化工食品学院，郑州 450044；2.河南农业大学 食品科学技术学院，郑州 450002；3.陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

选择大孔吸附树脂法和高速逆流色谱法对虎杖中白藜芦醇进行分离纯化。通过实验条件的优化以及对两种方法的比较发现：经大孔吸附树脂法分离纯化所得的白藜芦醇得率稍高，为0.21%，但纯度偏低，仅为51%；经高速逆流色谱法分离纯化所得的白藜芦醇得率稍低，为0.186%，但纯度大于96%，远远高于大孔吸附树脂法所得。

虎杖；白藜芦醇；大孔吸附树脂；高速逆流色谱

虎杖是我国传统的中药，白藜芦醇作为虎杖的有效成分具有抗氧化、抗菌、抗癌、预防心血管疾病等多种药理活性，[1]越来越受到人们的重视。目前，关于虎杖中白藜芦醇的提取及分离纯化的方法研究较多，本文选择大孔吸附树脂法与高速逆流色谱法，对虎杖提取液中白藜芦醇的分离纯化进行比较研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂及仪器

虎杖，市购；白藜芦醇标准品，外购；无水乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、浓盐酸、乙醚等皆为分析纯；X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、D-101树脂，外购。

1.2 主要仪器和设备

高效液相色谱仪，美国Waters公司；TBE-300型高速逆流色谱(分离)仪，上海同田生化技术有限公司；752型紫外-可见分光光度计，上海精密仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；玻璃层析柱，成都玻璃仪器厂；JA5003型电子天平，上海精科仪器有限公司；PHS-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

对白藜芦醇标准品进行紫外图谱扫描，确定白藜芦醇紫外最大吸收峰，通过对白藜芦醇的紫外分光测定、硅胶薄层层析、紫外图谱扫描及高效液相色谱[2-3]测定，建立紫外分光光度计跟踪检测、薄层层析、紫外图谱扫描及高效液相色谱定性定量测定的方法。

1.3.2 白藜芦醇粗提液的准备[4]

将干燥片状的虎杖根茎进行粉碎处理，然后过60目筛。根据前期实验结果，称取一定量粉碎合格的虎杖原料，按料液比1:20(g/mL)，加入体积分数80%的乙醇与丙酮1:1混合溶液，调整pH为4，在40℃条件下回流提取30min，共提取2次，然后抽滤，弃去滤渣，合并滤液。之后经旋转蒸发仪回收有机溶剂，得到虎杖有效成分的粗提物备用。

1.3.3 分离纯化

大孔吸附树脂法分离纯化：选择5种不同的大孔吸附树脂对虎杖提取液进行静态及动态吸附解吸实验，确定白藜芦醇分离纯化最适合的大孔吸附树脂及吸附解吸条件。

高速逆流色谱法分离纯化：考察不同的溶剂系统，根据虎杖中白藜芦醇分离纯化的结果选出最佳的溶剂系统及分离条件。[5-6]

1.3.4 高效液相色谱测定

将利用大孔吸附树脂法及高速逆流色谱法分离纯化所得产品进行高效液相色谱分析，根据面积外标法得出白藜芦醇含量，并计算求得产品纯度及得率。产品纯度为白藜芦醇质量(有效成分收集液的浓度×收集液体积)与有效成分收集液浓缩烘干后的固形物质量之比，得率为白藜芦醇质量与虎杖干重之比。

2 结果与讨论

2.1 白藜芦醇的标准曲线方程

根据白藜芦醇标准品的紫外扫描图谱(图略)，选择306nm作为白藜芦醇的测定波长。通过测定不同浓度白藜芦醇标准品在306nm下的吸光度，经计算得出白藜芦醇标准曲线方程为：y=7.6582x+0.0003(y为浓度，μg/mL；x为吸光度)，相关系数R2=0.9979。

2.2 大孔吸附树脂的筛选[7]

树脂吸附解吸量的大小是大孔吸附树脂法分离纯化的关键。本实验选取5种大孔吸附树脂经预处理后对虎杖提取液中的白藜芦醇进行静态吸附与解吸实验，结果见表1。

表1 不同树脂对白藜芦醇的吸附解吸性能

由表1可以看出，NKA-Ⅱ树脂的吸附率最高，其次为NKA-9，其他三种树脂吸附性能较差。在解吸方面，AB-8树脂最好，NKA-9次之。考虑到NKA-9树脂的吸附率和解吸率都较高，故选择NKA-9作为最佳树脂进行动态吸附解吸实验。

2.3 大孔吸附树脂法吸附条件的确定

2.3.1 料液浓度对吸附效果的影响

分次取18mL树脂湿法装柱，制取6份含白藜芦醇总量相同且高于该树脂饱和吸附量但浓度不同的虎杖提取液，上大孔吸附树脂柱进行动态吸附测定，结果见图1。由图1可以看出，在白藜芦醇总量相同的情况下，随着上柱浓度的增大，吸附率先增大后减小， 3～4mg/mL上柱浓度时吸附率最高，吸附量最大。因此，选择上柱浓度在3～4mg/mL之间。

图1 料液浓度对吸附率的影响

2.3.2 上柱速率对吸附率的影响

用蠕动泵分别控制6个不同的流速进行上柱吸附，通过上柱前后溶液有效成分的浓度差，计算吸附率，结果见图2。可以看出，上柱速率越大越不利于吸附，但上柱速率过小树脂吸附消耗的时间就多，当上柱速率超过1.0mL/min后，吸附率明显下降。综合考虑吸附率及效率，选择流速为1.0mL/min，即3.3BV/h。

图2 上柱速率对吸附率的影响

2.3.3 上样量对吸附率的影响

分次吸取2mg/mL浓度的粗提液样品7mL，8mL，9mL，10mL，11mL和12mL，上样于NKA9大孔吸附树脂的色谱柱中，静置15min，用蒸馏水淋洗至析出液无色，再用75%乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，测定并计算吸附率。由图3可以看出，当上样量为8mL时吸附效果最好。上样量继续增大，则超过了树脂的饱和吸附量，吸附率反而下降。因此，选择上样量为8mL，即0.45BV。

图3 上样量对吸附率的影响

2.3.4 进样 pH值对吸附率的影响

分别调整不同的样液pH，进行上样吸附，并测定吸附率，结果见图4。由图4可以看出，随着pH增加，吸附率先增加后下降，在pH4时，吸附率达到峰值。因此，确定上柱液的pH为4用于操作。

图4 pH对吸附率的影响

2.4 大孔吸附树脂法解吸条件的确定

2.4.1 解吸剂浓度的确定

分别选择体积分数20%、35%、50%、75%、100%的乙醇溶液对已经吸附有效成分的树脂进行洗脱，结果见图5。可以看出，随着乙醇浓度的升高，白藜芦醇的解吸率也随之升高，当浓度上升到75%以上时，解吸率增加不明显。故选用75%乙醇溶液进行解吸操作。

图5 不同浓度乙醇对解吸的影响

2.4.2 洗脱流速对解吸效果的影响

以不同流速的75%乙醇对吸附树脂进行解吸，结果见图6。可以看出，解吸率随流速的增大而减小，但随着流速的增大，生产效率会提高。综合考虑，确定洗脱流速为0.9mL/min，即3BV/h。

图6 洗脱流速对解吸的影响

2.4.3 洗脱剂的pH值对解吸效果的影响

考虑到白藜芦醇为偏酸性物质，偏碱性条件有利于白藜芦醇的解吸，因此选择pH7，pH8，pH9，pH10，pH11对白藜芦醇的解吸情况进行考察，结果见图7。由实验结果发现，解吸液在pH8效果最好。

2.4.4 动态解吸曲线

选择上柱液浓度3mg/mL，上柱量7mL。充分吸附后，以上述实验选择的解吸条件进行解吸操作，以解吸液体积为横坐标，白藜芦醇浓度为纵坐标，绘制解吸曲线，见图8。可以看出，有效成分大都在10～60mL的洗脱液中，随着乙醇的继续洗脱，剩余少量的白藜芦醇也逐渐被解吸下来，共需解吸液约135mL，即7.5BV(树脂床体积)。

图7 pH对解吸的影响

图8 白藜芦醇解吸曲线

2.5 高速逆流色谱法分离纯化白藜芦醇

2.5.1 溶剂体系的确定[8]

高速逆流色谱法分离纯化白藜芦醇的关键在于溶剂系统的选择。本文比较了两种不同的溶剂系统，一种是氯仿、甲醇、水系统，其比例为4:3:2；另一种是乙酸乙酯、乙醇、水系统，其比例为10:1:10。结果发现，第一种溶剂系统对于虎杖中的有效成分分离效果较好。因此，选择氯仿、甲醇、水的比例为4:3:2作为高速逆流色谱法分离纯化虎杖中白藜芦醇的溶剂体系。

2.5.2 分离条件的确定

经综合考察与比较，选择转速850r/min，流速2mL/min，进样量5mL提取液，紫外检测波长280nm作为分离条件。在确定的溶剂体系及分离条件下所得虎杖提取样品的高速逆流色谱见图9。可以发现，虎杖粗提物经过逆流色谱分离纯化得5个组分。分别收集，经薄层检测及紫外图谱扫描，发现第五个峰所得物质为白藜芦醇，且纯度较高。

2.6 白藜芦醇的高效液相色谱分析

将通过大孔吸附树脂法及高速逆流色谱法分离纯化所得的白藜芦醇产品上高效液相色谱柱，经高效液相色谱测定，利用大孔吸附树脂法分离纯化所得白藜芦醇得率为0.21%，纯度为51%；利用高速逆流色谱分离纯化所得白藜芦醇得率为0.186%，纯度大于96%。白藜芦醇的高效液相色谱图见图10。

图9 虎杖提取样品高速逆流色谱图

图10 白藜芦醇样品高效液相色谱图

3 结论

(1)本实验考察了5种大孔吸附树脂对虎杖中白藜芦醇的吸附解吸性能，发现NKA9树脂对白藜芦醇有较好的吸附和解吸效果。针对NKA9型树脂进行了吸附解吸工艺条件的优化，纯化工艺为：上样浓度4mg/mL，上样速率3.3BV/h，上样量0.45BV，pH4条件下吸附；解吸采用7.5BV的75%酒精，洗脱流速3 BV/h，pH为8。

(2)优化了高速逆流色谱法分离纯化虎杖中白藜芦醇的工艺条件。选择氯仿、甲醇、水的比例为4:3:2作为溶剂体系，转速850r/min，流速2mL/min，紫外检测波长280nm。

(3)通过对大孔吸附树脂法及高速逆流色谱法分离纯化虎杖中白藜芦醇的比较发现，大孔吸附树脂法作为低成本的分离纯化方法，所得白藜芦醇成品的得率为0.21%，纯度为51%，纯度较低；高速逆流色谱法相对生产周期短，所得白藜芦醇得率为0.186%，纯度大于96%，纯度较高，具有一定的应用推广价值。

[1]马超，郝青南，马兵钢.白藜芦醇的药理功能及分离检测研究进展[J].北方园艺，2008(4):61-65.

[2]郭金凤,崔一民.薄层层析法鉴别虎杖中的成分[J].中国药事, 1997, 11(1): 52-53.

[3]冯涛，刘鹏，刘海燕，等.双波长高效液相色谱法检测虎杖中活性成分[J].广州化工，2015(6):106-108.

[4]叶秋雄，黄苇.虎杖中白藜芦醇提取工艺研究[J].现代食品科技， 2013(6):1324-1327.

[5]魏云,曹学丽.值得关注的分离科学技术：逆流色谱技术[J].世界科学技术, 2001,3(5): 17-23.

[6]孙力,于鲁海.逆流色谱技术在植物药活性部位分离方面的应用[J].中国药房, 2003,14(4): 200-201.

[7]田娜，周达力，曹佩琴，等.大孔吸附树脂对白藜芦醇的分离纯化研究[J].中国农学通报，2013(22):147-151.

[8]陈雷，杨福全，张天佑，等.虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇甙的高速逆流色谱分离提纯及其分析[J].分析测试学报，2000(7):60-62.

(责任编辑 姚虹)

Comparative Study on Separation and Purification of Resveratrol from Polygonum Cuspidatum by Macroporous Adsorption Resin and HSCCC

CHENG Li-ying1, REN Hong-tao2, LIU Shu-xing3

(1.College of Chemical Engineering and Food, Zhengzhou Institute of Technology, Zhengzhou450044, China；2. College of Food Science & Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；3.College of Food & Biological Engineering, Shanxi University of Science and Technology, Xi’an 710021, China)

In this paper, two methods are selected to separate and purify of the resveratrol from Polygonum cuspidatum, macroporous adsorption resin method and HSCCC method. Through the optimization of experimental condition and the comparison of two methods, the results are as follows: The resveratrol yield is slightly higher by the macroporous adsorption resin purification, it is 0.21%,while the purity is low, only 51%; the resveratrol yield is slightly lower by the HSCCC method, and it is 0.186%. However, the purity by HSCCC is over 96%, which is much higher than macroporous adsorption resin purification.

Polygonum cuspidatum ; resveratrol; macroporous adsorption resin; HSCCC

2017-06-13

程丽英(1980—),女，河北石家庄人，工学硕士，郑州工程技术学院化工食品学院讲师，研究方向为食品科学。

10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2017.04.024

TQ461

A

1008-3715(2017)04-0113-04