羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜抑制兔后发性白内障的实验研究

胡艳红，陈 胜，胡 俊，李 颖，李四化，林淑娜，冯春燕，柯发杰

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州350003）

羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜抑制兔后发性白内障的实验研究

胡艳红，陈 胜，胡 俊，李 颖，李四化，林淑娜，冯春燕，柯发杰

（福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州350003）

目的：探讨羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜防治后发性白内障的有效性和安全性。方法：将16只（32只眼）新西兰白兔分别行超声乳化透明晶状体吸除术，并随机均分为4组：A组植入人工晶体襻上固定有载药量为50 μg羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜，B组植入人工晶体襻上固定有不含姜黄素的空白缓释药膜，C组植入人工晶体术毕后前房内注入20 mg/L姜黄素溶液，D组植入不含药膜的人工晶体；术后行裂隙灯显微镜检查，评价结膜充血、角膜水肿、前房闪辉、后发性白内障等，术后12 w对术眼行组织病理学检查。结果：术后C组炎症反应最重，A组和B组相当，但均较D组稍严重；术后12 w A、B、C、D组后发性白内障的发生率分别为25%（2/8）、75%（6/8）、62.5%（5/8）、100%（8/8）；光镜下各组角膜、虹膜、视网膜结构无明显差异。结论：羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜植入兔眼能明显减少后发性白内障的发生，且对眼内角膜、虹膜、视网膜等组织无明显毒副作用，能安全、有效地防治后发性白内障。

后发性白内障；姜黄素；缓释系统；羧甲基壳聚糖

姜黄素是一种从姜科植物姜黄等的根茎中提取得到的一种黄色色素，为酸性多酚类物质，通常用作肉类食品着色剂和酸碱指示剂，因其安全无毒且同时具有抗炎、抗氧化、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等作用，故在生物医药研究领域尤其是肿瘤研究方面得到广泛应用［1-3］。课题组前期体外研究发现，姜黄素能抑制晶状体上皮细胞增殖、诱导凋亡，可有效防治后发性白内障［4-5］。为了进一步进行在体研究，本研究将姜黄素制备成羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜，将其植入兔眼观察其对后发性白内障的影响及其眼内副作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 普通级新西兰大白兔16只（32只眼），购于上海市松江区松联实验动物场［许可证号：SCXK（沪）2012-0011］，体质量2.2~2.5 kg，雌雄不限，体毛整洁、光亮，健康状况良好，双眼正常，单笼饲养，适应性喂养1 w后手术。

1.1.2 实验试剂 姜黄素粉末（纯度≥98.5%，美国Sigma公司产品）；羧甲基壳聚糖（青岛弘海生物技术有限公司）。苏木素、伊红均由福建中医学院附属人民医院病理科提供。

1.1.3 实验仪器 ZEISS眼科手术显微镜（S8，德国蔡司公司）；超声乳化仪（Signature，美国眼力健公司）；裂隙灯显微镜（BQ900，德国蔡司公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜的制备 取羧甲基壳聚糖（10万分子量），加4 mL超纯水完全溶涨。称取姜黄素5 mg用0.25 g甘油溶解，然后加入羧甲基壳聚糖溶液中，混合均匀，涂布在玻璃板上，面积大小8 cm×8 cm。然后置于40℃烘箱中烘干（约1.5 h），即得橙黄色半透明柔软薄膜，体外实验具有一定的缓释效应，能很好地固定于人工晶体表面［6］。

1.2.2 实验分组及手术方法 16只新西兰大白兔32只眼采用随机数字表法分成4组，每组8只眼，每组均行透明晶状体超声乳化摘除。A组植入人工晶体襻上固定有载药量为50 μg羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜，B组植入人工晶体襻上固定有不含姜黄素的空白缓释药膜，C组植入人工晶体术毕后前房内注入20 mg/L姜黄素溶液，D组植入不含药膜的人工晶体。术后每日术眼点妥布霉素地塞米松滴眼液，4次/d，复方托吡卡胺滴眼液，2次/d，妥布霉素地塞米松眼膏每晚1次。

1.2.3 术后术眼常规检查 分别于术后1 d、1 w、4 w、12 w行裂隙灯显微镜检查及眼压检查，评价结膜充血、角膜水肿、房水混浊、后囊膜混浊等情况。检查评价标准如下：①充血分级：无充血为0级，轻度睫状充血为1级，轻中度睫状充血为2级，重度睫状充血为3级。②角膜水肿分级：无角膜水肿为0级，厚度增加1/4 CT为1级，厚度增加1/3 CT为2级，厚度增加1/2 CT或以上为3级。③房水混浊分级：前房无细胞为0级，可见细胞为1级，纤维形成为2级，前房积脓为3级。④后囊膜混浊分级：后囊无混浊为0级，后囊轻度混浊能看清眼底为1级，后囊中度混浊眼底部分模糊不清为2级，后囊轻度明显混浊眼底看不清或周边环状皮质增生为3级。

1.2.4 眼内组织病理检查 术后12 w空气栓塞处死兔子，取眼球立即放入10%甲醛溶液内4℃固定4 h以上，苏木素染色20 min，充分水洗，0.5%伊红染色2～3 min，再脱水、透明，中性树胶封片，普通光学显微镜下观察角膜、后囊膜、虹膜、视网膜各组织情况。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 19.0软件统计。术前术后各组眼压的比较采用“重复测量数据的方差分析”，分析各时间点眼压值的时间差异性，组间两两比较采用LSD-t检验；各组结膜充血、角膜水肿及房水混浊情况采用Kruskal-Wallis H检验，各组后发性白内障发生率采用Fisher分析。

2 结果

2.1 术眼眼压及术后炎性反应

术后1 d、1 w、4 w、12 w各组眼压平均波动在8～17 mmHg之间，与术前比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

术后第1天A、B、C、D各组兔眼炎症反应均较重，各兔眼均出现不同程度的结膜充血、角膜水肿，房水混浊，但相比之下C组炎症反应最重，D组最轻，A组和B组相当，各组出现前房渗出物的眼数分别为：4、4、6、3只眼；但术后1 w各组炎症反应明显减轻，A、B、C、D各组结膜充血、角膜水肿，房水混浊分级评定情况见表1，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组兔眼术后1 w结膜充血、角膜水肿及房水混浊情况（眼数）

2.2 术眼后发性白内障情况结果见表2。

表2 各组兔眼术后12 w晶状体后囊膜混浊情况 （眼）

由表2可见，术后12 w A、B、C、D各组后发性白内障的发生率分别为25%（2/8）、75%（6/8）、62.5%（5/8）、100%（8/8），D组发病率最高，A组最低，且D组后囊膜混浊的程度最重，A组最轻（χ2= 13.070，P=0.004）。

2.3 术眼组织病理学检查情况

术后12 w光镜下可见D组后囊膜单层或多层成纤维细胞增殖，细胞排列紧密，A组光镜下后囊膜几乎无细胞以及纤维蛋白黏附，边缘区可见前、后囊膜之间成纤维细胞增殖到一定区域不再增殖，B、C组可见不同程度的后囊膜上片状成纤维细胞增殖；A、B、C、D各组虹膜、睫状体及视网膜均未见明显炎性细胞浸润，与正常兔眼相比未见明显病理改变。结果见图1。

3 讨论

课题组前期大量的体外研究证明姜黄素可作为防治后发性白内障的药物，但如何安全有效的在体给药成为下一步研究的重点。如果全身给药会导致眼部药物浓度太低；如果采用局部滴眼液的形式给药，仍然达不到有效的眼内药物浓度；如果术中或术后直接眼内给药，将会因为药物浓度偏高可能对眼内其他组织造成影响。本研究前期将姜黄素粉末制备成一定浓度的羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜，发现所制备的药膜呈橙黄色半透明柔软薄膜，成膜性能良好，膜的可塑性强，可以很好地固定在人工晶体襻上，且不会影响人工晶体襻的形状［6］。

图1 羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜植入后眼内各组织病理改变

本研究中术后第1天各组兔眼均出现不同程度炎症反应，但术后1 w各组炎症反应均明显减轻，植入姜黄素缓释药膜组和空白药膜组与不含药膜的D组在结膜充血、角膜水肿，房水混浊分级上无明显差异，各组虹膜、睫状体及视网膜均未见明显炎性细胞浸润，与不含药膜的D组相比未见明显病理改变，提示姜黄素缓释药膜和空白药膜均未加重兔眼术后的眼部炎症反应，亦未出现明显的眼内排斥反应，羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜是一种理想的药物载体。一方面可能与药物载体羧甲基壳聚糖具有水溶性、胶凝性、促渗透性、生物相容性和可降解性等特点有关［7］；另一方面也与姜黄素本身安全无毒有关［8］。而注入姜黄素溶液的C组表现为较重的眼部炎症反应，这可能是短时间内前房内高浓度药物注入及房水渗透压的改变从而发生严重的无菌性炎症反应，说明前房注射姜黄素的给药方式可能不适合应用于临床。

本研究结果还发现植入人工晶体襻上固定有载药量为50 μg羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜可以有效抑制兔眼后发性白内障的发生，减轻后发性白内障的严重程度，这可能与姜黄素能有效抑制LEC的增殖和诱导LEC凋亡有关［4-5］。

本研究结果显示，羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜可抑制兔眼后发性白内障的发生，且对眼内组织无明显的毒副作用，术眼眼压亦无异常波动，可能成为防治后发性白内障的安全有效的给药途径和方法。而羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜眼内的有效剂量、药代动力学、远期的眼内毒副作用等还有待进一步研究。

［1］Bharat B Aggarwal，Subash C Gupta，Bokyung Sung.Curcumin：an orally bioavailable blocker of TNF and other pro-inflammatory biomarkers［J］. Br J Pharmacol，2013，169（8）：1 672-1 692.

［2］Murali M，Yallapu Prashanth K，Bhusetty Nagesh，et al.Therapeutic applications of curcumin nanoformulations［J］.AAPS J，2015，17（6）：1 341-1 356.

［3］Avijit Sarkar，Ronita De，Asish K Mukhopadhyay.Curcumin as a potential therapeutic candidate for?Helicobacter pyloriassociated diseases［J］. World J Gastroenterol，2016，22（9）：2 736-2 748.

［4］胡艳红，黄秀榕，祁明信，等.姜黄素抑制人晶状体上皮细胞增殖与胶原蛋白合成的研究［J］.中华中医药杂志，2011，26（9）：2 103-2 106.

［5］Hu Yanhong，Huang Xiurong，Qi Mingxin，et al.Curcumin inhibits proliferation of human lens epithelial cells：a proteomic analysis［J］.J Zhejiang Univ-Sci B（Biomed&Biotechnol），2012，13（5）：402-407.

［6］胡艳红，陈胜，黄秀榕，等.羧甲基壳聚糖载姜黄素缓释药膜的制备及其体外缓释动力学［J］.齐齐哈尔医学院学报，2016，37（28）：3 512-3 514.

［7］王美娜，李苑新，蔡兴.羧甲基壳聚糖的性能及应用概况［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21（1）：228-232.

［8］Murali M Yallapu，Meena Jaggi，Subhash C Chauhan.Curcumin nanoformulations：a future nanomedicine for cancer［J］.Drug Discov Today，2012，17（1/2）：71-80.

（编辑：翟春涛）

Experimental study of inhibition after cataract of curcumin-chitosan delivery system in rabbit

Hu Yanhong，Chen Sheng，Hu Jun，Li Ying，Li Sihua，Lin Shuna，Feng Chunyan，Ke Fajie
（The Second Affiliated People′s Hospital of Fujian College of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou Fujian 350003）

Objective：To discussion the carboxymethyl chitosan contained curcumin efficacy and safety on after cataract in rabbit.Methods：The 16（32 eyes）New Zealand white rabbits were performed in suction transparent lens phacoemulsification surgery and were randomly divided into four groups：A group was implanted with the IOL haptics fixed with drug loading 50 μg carboxymethyl chitosan curcumin slow release carrier film，group B implants fixed without curcumin on film with sustained release intraocular lens haptics blank，group C after intraocular lens implantation surgery in the anterior chamber injection 20 mg/L curcumin solution，D group IOL implantation without the membrane in；postoperative slit lamp microscope to evaluate conjunctival hyperemia，corneal edema，anterior chamber flare，after cataract，etc.，12 weeks for eye surgery histopathological examination.Results：Group C after inflammation heaviest，A and B groups are equivalent，but slightly harder than that in group D；12 weeks after the incidence of A，B，C，D group after cataract were 25%，75%，62.5%，100%；light microscope groups cornea，iris，retina structure was no significant difference.Conclusion：Carboxymethyl chitosan sustained-release film with curcumin contained plasticity，easy installation operation，and film with a certain release properties，although the release was faster，but enough to meet cataract extraction and intraocular lens implantation surgery use.Implanted within the eye can significantly reduce the occurrence of after cataract，and no significant side intraocular cornea，iris，retina and other tissues of side effects，safe and effective prevention and treatment of after cataract.

after cataract；curcumin；drug delivery system；carboxymethyl chitosan

R285.5

A

1671-0258（2017）04-0010-04

福建省自然科学基金项目（2014J01423）；福建省卫生厅中青年骨干人才培养项目（2014-ZQN-JC-31）；福建省卫生厅中医药重点项目（wzhw201301）

胡艳红，副主任医师，博士，E-mail：12212022@163.com