非小细胞肺癌血清中lncRNA HOTAIR的表达及临床意义

谭楠 李莉红 白璐 赵昆

肺癌是起源于支气管粘膜或腺体的恶性肿瘤，是发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，根据统计肺癌的年发病人数及年死亡人数均居全球肿瘤首位[1]。肺癌的发病机制尚未完全明确，可能与吸烟、职业、环境接触、电离辐射、既往肺部慢性感染、遗传及大气污染等因素有关，肺癌的早期症状不明显，甚至可无任何不适，因此研究肺癌的发病机制及早期诊断对肺癌的治疗及预后至关重要。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是在表观遗传、转录以及转录后等多种层面上调控基因的表达水平[2,3]，研究证实lncRNA广泛参与了细胞增殖、分化及凋亡等过程，在多种疾病病理过程中发挥重要作用[4]，与肿瘤的发病、转移、预后及治疗密切相关[5,6]。HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）是一种新近发现具有反式转录调控作用的lncRNA[7]，国内外研究[8-12]发现HOTAIR在肺癌组织中高表达，且与肺癌的临床分期、淋巴结转移及预后有关。为了进一步研究HOTAIR在肺癌诊断及预后中的作用，本实验采用实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）检测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者血清中HOTAIR水平，并分析其与临床病理参数之间的关系。

1 资料与方法

1.1 病例资料 选取西安市第一医院2016年1月-2016年11月期间经过组织病理确诊的NSCLC患者64例，其中男性38例，女性26例，年龄32岁-75岁，平均（56.4±10.7）岁，组织病理类型为鳞癌23例、腺癌39例、大细胞癌2例，分期采用2009年国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control, UICC）（第7版）肺癌肿瘤-淋巴结-转移（tumor-node-metastasis, TNM）分期标准进行：I期15例，II期20例，III期26例，IV期3例。64例健康体检者作为正常对照组，其中男性40例，女性24例，年龄26岁-71岁，平均（53.4±9.6）岁，本研究经过医院伦理委员会批准并征得所有研究对象的知情同意。

1.2 样本采集 所有患者均在进行手术、化疗或放疗前进行采样，空腹无菌采取静脉血5.0 mL，放置30 min后1,200 g离心10 min，吸取上清至离心管中，4oC 12,000 g再离心10 min后分离上清至新的离心管中，取250 μL血清加入750 μL TRIzol® LS试剂后-80oC保存待用。

1.3 总RNA提取及cDNA第一链合成 参照文献[13]严格按照TRIzol® LS试剂（美国Invitrogen公司）说明书进行血清总RNA提取，提取的RNA溶于DEPC处理的水中。采用逆转录试剂盒（美国Thermo Scientific公司）进行cDNA第一链合成，具体如下：3 μg总RNA、5 μg/μL Oligo(dT)1 μL温和混合后70oC孵育5 min，冰上冷却，短暂离心收集上清；依次加入5×反应缓冲液4 μL、20 U/μL RNase抑制剂1 μL及10 mmol/L dNTP 2 μL 37oC温和混合后孵育5 min；加入200 U/μL M-MuLV逆转录酶1 μL，42oC 60 min、70oC 10 min，冰上冷却终止反应；合成的cDNA第一链在-20oC保存待用。

1.4 实时定量PCR检测 根据Genebank中HOTAIR及内参GAPDH的序列，利用Primer 5.0软件设计引物，具体序列如下：HOTAIR上游引物5'-GGCAGCACAGAGCAACTCTA-3'，下游引物5'-GCAGGGTCCCACTGCATAAT-3'，扩增产物大小125 bp；GAPDH上游引物5'-ACTAGGCGCTCACTGTTCTCT-3'，下游引物5'-GヰGACTCCGACCヰCACCT-3'，扩增产物大小83 bp，由上海生工生物技术科技有限公司合成引物。利用SYBR® Premix Ex TaqTMII（大连宝生物工程有限公司）进行PCR扩增，20 μL反应体系包括10 μL SYBR® Premix Ex TaqTM II（2×）、模板3.0 μL、上下游引物（10 μM）各1.0 μL、ddH2O 5.0 μL，PCR反应条件：95oC预变性30 s，95oC 10 s、60oC 30 s共35个循环。扩增结束后得到Ct值，采用2-△△Ct法计算血清中HOTAIR的表达水平。

1.5 统计学方法 所有数据均采用SPSS 16.0进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差（Mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOTAIR在NSCLC患者血清中的水平 实时定量PCR检测结果发现NSCLC患者血清中HOTAIR水平为（2.85±1.16），明显高于正常对照组（1.74±0.69），两组之间差异具有统计学意义（t=6.566, P＜0.01）。

2.2 NSCLC患者血清中HOTAIR水平与临床病理参数之间的关系 为了进一步研究HOTAIR在NSCLC发生、发展中的作用，本研究统计分析了肺癌血清中HOTAIR水平与临床病理参数之间的关系，结果发现血清中HOTAIR水平与患者性别、年龄、吸烟、分化程度及病理类型均无明显相关（P＞0.05）。而肿瘤大小＞3 cm的肺癌患者血清中HOTAIR水平明显高于肿瘤大小≤3 cm患者，III期+IV期肺癌患者血清中HOTAIR水平明显高于I期+II期患者，有淋巴转移的肺癌患者血清中HOTAIR水平明显高于无淋巴转移的患者，差异均具有统计学意义（P＜0.05），结果见表1。

3 讨论

非编码RNA（non-coding RNA）是指不编码蛋白质的RNA，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA、lncRNA及circRNA。由于lncRNA不编码蛋白质，最初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。但随着RNA测序、芯片等分子生物学技术和生物信息学的不断发展，越来越多的研究[4-6]证实lncRNA具有复杂的生物学功能，在多个层面上参与细胞分化和个体发育调控，并与多种疾病尤其是恶性肿瘤的发生发展密切相关。国内外学者研究[14-16]发现MALAT1、ANRIL、H19、MEG3、GAS5及CCAT2等多种lncRNAs在肺癌中异常表达，与肺癌的发病、诊断、治疗及预后密切相关。HOTAIR是Rinn等[7]发现的第一个具有反式转录调控作用的lncRNA，人HOTAIR基因定位于12q13区域，基因（RefSeq NR_003716）全长2,364 bp，由1个长外显子和5个短外显子组成，HOTAIR主要是通过5'结构域和3'结构域募集复杂蛋白复合体来调控靶基因的表达。多项研究发现HOTAIR不仅在乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌等实体瘤中高表达[17,18]，而且在淋巴瘤、急性白血病等血液系统恶性肿瘤中也高表达[19,20]。国内外学者[8-12,21]研究发现NSCLC患者肿瘤组织中的HOTAIR的表达水平明显高于正常肺组织，细胞实验证实过表达HOTAIR可以显著促进A549细胞的迁移和侵袭，且与顺铂化疗耐药有关。由于lncRNA具有疾病特异性和组织特异性、稳定性高等特点，在心血管疾病、肿瘤患者外周循环中可以检测到lncRNA，有可能成为疾病诊断、预后的标志物[22,23]。本研究采用实时定量PCR检测NSCLC患者血清中HOTAIR的水平，结果发现NSCLC患者血清中HOTAIR水平明显高于正常对照组（P＜0.01），这与国内外学者在肺癌组织中的研究结果一致[8-12]，提示HOTAIR在NSCLC病理过程中发挥了重要作用。

表 1 NSCLC患者血清中HOTAIR水平与临床病理参数的关系Tab 1 The relationships between the serum levels of HOTAIR and clinical pathological parameters in the patients with NSCLC

本研究进一步分析了NSCLC患者血清中HOTAIR水平与临床病理参数之间的关系，结果发现肿瘤大小＞3 cm的肺癌患者血清中HOTAIR水平明显高于肿瘤大小≤3 cm患者，III期+IV期肺癌患者血清中HOTAIR水平明显高于I期+II期患者，提示HOTAIR与TNM分期及肿瘤负荷有关，与国内外学者研究结果[8-12]一致，本研究还发现I期+II期患者血清中HOTAIR水平仍然明显高于正常对照组（P＜0.01），随着研究的不断深入HOTAIR有可能成为肺癌的早期诊断指标之一。同时研究结果还发现有淋巴转移的肺癌患者血清中HOTAIR水平明显高于无淋巴转移的患者，有研究表明过表达HOTAIR可以显著促进肺癌细胞A549的迁移和侵袭[11,24]，提示HOTAIR参与了肺癌的侵袭及转移过程。本研究结果显示肺癌患者血清中HOTAIR水平与患者性别、年龄、吸烟、分化程度及病理类型均无明显相关，但张泽雨[10]等发现NSCLC患者肿瘤组织中HOTAIR的水平与肿瘤的分化程度明显相关，这可能与病例的选择有关，有待于扩大样本量进行进一步研究。

综上所述，本研究发现NSCLC患者血清中HOTAIR水平升高，且与肿瘤大小、TNM分期及淋巴转移有关，提示HOTAIR与肺癌的发生发展及转移有关，但其具体作用机制尚不明确。由于肺癌的临床表现比较复杂，早期症状不明显，甚至可无任何不适，因此肺癌的早期诊断尤为重要，随着对HOTAIR研究的不断深入，可能为肺癌的早期诊断及治疗提供新的靶点。