海马区血小板活化因子合酶及其受体的表达对选择性神经损伤大鼠痛觉敏化的影响*

杨京利， 张 力， 向 勇， 马国平

1复旦大学附属浦东医院麻醉科，上海 201399 2湖北医药学院附属太和医院疼痛科，十堰 442000 3上海市浦东新区周浦医院麻醉科，上海 201318

海马区血小板活化因子合酶及其受体的表达对选择性神经损伤大鼠痛觉敏化的影响*

杨京利1， 张 力2， 向 勇2， 马国平3△

1复旦大学附属浦东医院麻醉科，上海 2013992湖北医药学院附属太和医院疼痛科，十堰 4420003上海市浦东新区周浦医院麻醉科，上海 201318

目的 探讨海马区血小板活化因子(PAF)合酶(LPCAT1、LPCAT2)及其受体(PAFR)在大鼠坐骨神经分支选择性神经损伤(SNI)所致神经病理性疼痛中的作用。方法 选择海马区置管成功的雄性SD大鼠40只，随机分为4组(n=10)：假手术组(Sham组)，模型组(SNI组)，模型+银杏内酯B组(SNI+BN52021组)和溶剂对照组(SNI+HBC组)。SNI+BN52021组在SNI手术后2 d通过海马区微量注射给予银杏内酯B 10 μg(溶解于1 μL的HBC溶液)，SNI+HBC组则给予1 μL的HBC溶液。分别于术前1 d和术后1、3、5、7、10、14 d记录各组动物的机械缩爪阈值(PWMT)和辐射热缩爪潜伏期(PWTL)；第15天取大鼠新鲜海马组织，RT-PCR检测LPCAT1、LPCAT2以及PAFR的表达。结果 SNI大鼠PWMT值术后第1天开始明显降低(P<0.05)，海马组织中LPCAT2及PAFR的表达增强(均P<0.05)，LPCAT1的表达变化不明显(P>0.05)；海马区微量注射BN52021组大鼠的PWMT值升高，海马组织中LPCAT2及PAFR的表达下降(均P<0.05)。结论 海马区微量注射银杏内酯B可减轻SNI大鼠的机械性痛敏，抑制海马区LPCAT2和PAFR的表达，海马区PAF/PAFR信号通路可能参与了SNI大鼠神经病理性疼痛机制。

银杏内酯B； 神经病理性疼痛； 海马； 血小板活化因子

血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)是体内重要的磷脂类递质，PAF及其受体参与慢性疼痛的中枢敏化机制。银杏内酯B(Ginkgolide B，BN52021)是PAF受体(platelet-activating factor receptor，PAFR)特异性拮抗剂，海马区微量注射BN52021可减轻甲醛诱导的炎性痛[1]。Okubo等[2]的研究证实，脊髓背角PAF合酶(LPCAT1、LPCAT2)及其受体的表达上调参与了选择性神经损伤(spared nerved injury，SNI)大鼠的神经病理性疼痛，而鞘内注射银杏内酯B可以减轻SNI大鼠的机械性异常痛敏，抑制神经损伤后脊髓背角c-fos的表达[3]。本研究通过观察海马区微量注射银杏内酯B对SNI大鼠痛阈和海马组织PAF合酶及其受体表达的影响，进一步探讨银杏内酯B对神经病理性疼痛的镇痛效应及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体重250～300 g，由湖北医药学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(鄂)2011-0031。

1.2 仪器设备

电子自动爪测痛仪(electronic von Frey anesthesiometer，IITC公司，美国)；辐射热测痛仪(Model 390G型，IITC公司，美国)。

1.3 试剂

银杏内酯B购自Sigma公司，溶解于45%的羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HBC)溶液；HBC购自北京百威灵生物科技公司，溶解于无菌双蒸水形成45%的HBC溶液；PCR试剂盒购自康为世纪公司。

1.4 神经病理性疼痛模型的建立及分组

40只大鼠随机分成4组，假手术组(Sham组)、SNI手术组、SNI+HBC对照组以及SNI+BN52021组。参考Gurtskaia等[4]的方法行海马区置管术7 d后，参照Decosterd等[5]的方法建立SNI神经病理性疼痛模型。SNI手术后第2天经预置头部的导管给药：银杏内酯B治疗组选择1 μL微量进样器缓慢注入银杏内酯B(10 μg/μL)，SNI+HBC对照组则给予45%的HBC溶液1 μL。药物配制方法、给药剂量的选择见参考文献[5]。

1.5 行为学检测

建立SNI模型前1 d测定基础痛阈，手术后1、3、5、7、10和14 d分别测定大鼠热痛阈和机械痛阈，测定时间恒定于每日9：00～15：00，室温维持在(25±1)℃。参照Vivancos等[6]的方法，采用电子自动爪测痛仪检测大鼠机械缩爪阈值(paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)；参照Hargreaves等[7]的方法，采用辐射热测痛仪检测辐射热缩爪潜伏期(paw withdrawal thermal latency，PWTL)。

1.6 海马组织LPCAT1、LPCAT2及PAFR表达的RT-PCR检测

各组大鼠在SNI术后15 d断头处死，随机选取6只大鼠的新鲜海马组织，预冷PBS溶液冲洗去除残留血液，取100 mg海马组织于匀浆器中，用Trizol试剂提取总RNA，然后分光光度计检测A260 nm/A280 nm比值。PCR试剂盒(2×Taq MasterMix，目录号：CW0682)检测海马组织中PAF合酶LPCAT1、LPCAT2及其受体PAFR的表达。1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶分析软件处理，以LPCAT1、LPCAT2、PAFR与β-actin的比值表示其表达水平。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 海马区微量注射银杏内酯B对SNI大鼠神经病理性疼痛的影响

Sham组大鼠术前与术后PWMT未见明显变化，SNI组、SNI+HBC组大鼠于手术后1 d左后肢出现机械性痛觉超敏，至术后7 d达到最低阈值并在观察时间内维持稳定，与SNI组相比，SNI+BN52021组大鼠术后各时点痛阈值明显升高，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图1。各组大鼠PWTL差异无统计学意义(均P>0.05)，见图2。

图1 各组大鼠机械缩爪阈值的比较Fig.1 Comparison of paw withdrawal mechanical threshold in rats of different groups

图2 各组大鼠辐射热缩爪潜伏期的比较Fig.2 Comparison of paw withdrawal thermal latency in rats of different groups

2.2 海马区微量注射银杏内酯B对SNI大鼠海马组织中PAF合酶及其受体表达的影响

与Sham组相比，SNI组、SNI+HBC组大鼠海马组织中LPCAT1基因表达增加不明显(均P>0.05)，LPCAT2、PAFR表达增加，差异有统计学意义(均P<0.05)。与SNI组和SNI+HBC组比较，SNI+BN52021组大鼠海马区LPCAT2、PAFR基因表达下降，差异有统计学意义(均P<0.05)，见图3和图4。

A：Sham组；B：SNI组；C：SNI+BN52021组；D：SNI+HBC组图3 各组大鼠海马区LPCAT1、LPCAT2和PAFR表达的RT-PCR电泳图Fig.3 RT-PCR electrophorogram of LPCAT1，LPCAT2 and PAFR in hippocampus of rats of different groups

与Sham组比较，*P<0.05；与SNI+BN52021组比较，▲P<0.05图4 各组大鼠海马区LPCAT1、LPCAT2和PAFR的表达Fig.4 RT-PCR analysis of LPCAT1，LPCAT2 and PAFR in hippocampus of rats of different groups

3 讨论

PAF是一种具有多种生物活性的内源性磷脂类介质，由Ca2+依赖性细胞型磷脂酶A2(cPLA2)催化甘油磷脂产生PAF的前体LysoPAF，再通过PAF合酶，即溶血卵磷脂酰基转移酶1(lysophosphatidylcholine acyltransferase 1，LPCAT1)和LPCAT2的作用使LysoPAF转变为PAF，PAF通过与G-蛋白耦联的特异性PAF受体结合发挥其生物效应。研究表明，LPCAT1在生理条件下即可表达，属于不依赖于炎症信号刺激的结构型合酶，而LPCAT2在炎症刺激的病理生理条件下诱导产生并发挥作用，属诱生型合酶[8]。

PAF在神经组织中广泛存在，中枢神经元及神经胶质细胞均可产生PAF。体外实验表明，大脑皮质神经元、小胶质细胞、小脑颗粒细胞和海马神经元在相应的刺激下可产生和释放PAF。大量研究表明，PAF可能参与了疼痛信号的转导和调控过程。鞘内注射PAF可诱发小鼠的机械性痛敏和热痛敏，而腹腔注射PAF受体拮抗剂BN52021则可以减轻甲醛诱导的炎性伤害感受反应[9]。Tsuda等[10]发现，PAF受体基因敲除的小鼠生理状态下对热和机械刺激呈现正常反应，而局部注射甲醛和辣椒素以及内脏炎症诱发的炎性痛小鼠则表现为疼痛反应减轻，同时，参与初级感觉神经元敏化的重要激酶——细胞外信号相关蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的磷酸化水平降低，研究结果表明PAF及其受体在组织损伤所诱发的初级感觉神经元敏化及慢性疼痛中发挥着重要作用。

海马是边缘系统的重要组成部分，研究表明，长期慢性疼痛伴有海马区的异常变化，包括ERK的表达和磷酸化水平减弱、神经元再生的减少以及短时程突触可塑性的改变。另有研究证实，海马区微量注射非甾体类镇痛药可通过激活内源性阿片系统产生抗伤害感受性作用[4]；给予PAF的膜受体拮抗剂BN52021则能够减轻甲醛诱导的炎性疼痛，PAF能够激活海马CA1区多种蛋白激酶，诱导突触易化，增加神经突触的效能[1]。本实验研究表明，外周神经损伤可导致大鼠产生机械性痛敏，同时伴有海马内的PAF合酶LPCAT2和PAF受体表达增加，而LPCAT1表达增加不明显。海马区微量注射银杏内酯B可减轻SNI的机械性痛敏，并且抑制海马内LPCAT2和PAF受体表达增强，对LPCAT1的表达无明显影响。本研究结果证实了海马区PAF和PAFR信号通路在神经病理性疼痛中的作用，通过拮抗PAF受体可调控LPCAT2的表达进而影响PAF的产生。

综上所述，外周神经损伤可诱发大鼠机械性痛敏，海马区PAF合酶及PAFR的表达上调参与其敏化机制。银杏内酯B作为PAF的膜受体拮抗剂，可通过影响海马内LPCAT2及PAFR的表达，抑制神经病理性疼痛的中枢敏化。

[1] Teather L A，Afonso V M，Wurtman R J.Inhibition of platelet-activating factor receptors in hippocampal plasma membranes attenuates the inflammatory nociceptive response in rats[J].Brain Res，2006，1097(1)：230-233.

[2] Okubo M，Yamanaka H，Kobayashi K，et al.Up-regulation of platelet-activating factor synthases and its receptor in spinal cord contribute to development of neuropathic pain following peripheral nerve injury[J].Mol Pain，2012，8(8)：1-11.

[3] 马国平，杨京利，田玉科，等.鞘内注射银杏内酯B对神经病理痛大鼠痛阈及脊髓c-fos表达的影响[J].中国疼痛医学杂志，2009，15(3)：154-157.

[4] Gurtskaia G，Tsiklauri N，Nozadze I，et al.Antinociceptive tolerance to NSAIDs microinjected into dorsal hippocampus[J].BMC Pharmacol Toxicol，2014，15(10)：1-8.

[5] Decosterd I，Woolf C J.Spared nerve injury：an animal model of persistent peripheral neuropathic pain[J].Pain，2000，87(2)：149-158.

[6] Vivancos G G，Verri W A Jr，Cunha T M，et al.An electronic pressure-meter nociception paw test for rats[J].Braz J Med Biol Res，2004，37(3)：391-399.

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[9] Teather L A，Magnusson J E，Wurtman R J.Platelet-activating factor antagonists decrease the inflammatory nociceptive response in rats[J].Psychopharmacology(Berl)，2002，163(3/4)：430-433.

[10] Tsuda M，Ishii S，Masuda T，et al.Reduced pain behaviors and extracellular signal-related protein kinase activation in primary sensory neurons by peripheral tissue injury in mice lacking platelet-activating factor receptor[J].J Neurochem，2007，102(5)：1658-1668.

(2017-03-14 收稿)

Roles of Platelet-activation Factor Synthases and Its Receptor in Neuropathic Pain Induced by Spared Nerve Injury in Hippocampus of Rats

Yang Jingli1，Zhang Li2，Xiang Yong2etal

1Department of Anesthesiology，the Affiliated Shanghai Pudong Hospital of Fudan University，Shanghai 201399，China2Department of Pain Clinic，the Affiliated Taihe Hospital of Hubei Medical University，Shiyan 442000，China

Objective To investigate the roles of platelet-activating factor(PAF)synthases(LPCAT1 and LPCAT2)and its receptor(PAFR)in neuropathic pain induced by spared nerve injury(SNI)in hippocampus.Methods Totally，40 SD rats with the cannula stereotaxically implanted into the dorsal hippocamus were randomly divided into 4 groups：Sham group，SNI group，Ginkgolide B group(SNI+BN52021 group)and vehicle control group(SNI+HBC group).The rats in SNI+BN52021 group were administered by intrahippocampal injection with Ginkgolide B 10 μg/μL 2 days after SNI surgery，and the rats in SNI+HBC group were administered by intrahippocampal injection with 45% HBC 1 μL.The paw withdrawal mechanical threshold(PWMT)and paw withdrawal thermal latency(PWTL)were recorded 1 day before surgery and 1，3，5，7，10 and 14 days after surgery.The expression of PAF synthases(LPCAT1 and 2)and PAF receptor(PAFR)in hippocampus were detected by RT-PCR.Results PWMT decreased significantly 1 day after surgery in SNI group(P<0.05).The expression levels of LPCAT2 and PAFR were increased significantly in hippocampus in SNI group(P<0.05).PWMT increased significantly in SNI rats administered by intrahippocampal injection with Ginkgolide B(P<0.05)，and the expression of LPCAT2 and PAFR decreased significantly in hippocampus in SNI+BN52021 group(P<0.05).Conclusion Intrahippocampal injection with Ginkgolide B could decrease the expression of LPCAT2 and PAFR，and alleviate mechanical hyperalgesia.It suggests that PAF/PAFR in hippocampus participates in the mechanism of neuropathic pain after SNI surgery.

Ginkgolide B； neuropathic pain； hippocampus； platelet-activating factor

*湖北省教育厅科研基金资助项目(No.D20132405);上海市浦东新区卫生人才培养计划资助项目(No.PWRd2014-19)

R745.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.017

杨京利，女，1977年生，副主任医师，E-mail：yangjinglisy@126.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：gpmshiyan@126.com