核苷酸结合寡聚化结构域1和2基因在幽门螺杆菌相关胃癌中的表达及意义

王雪纯，张凤芹

（1.河北医科大学口腔学院，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学附属哈励逊国际和平医院 病理科，河北 衡水 053000）

新进展研究·论著

核苷酸结合寡聚化结构域1和2基因在幽门螺杆菌相关胃癌中的表达及意义

王雪纯1，张凤芹2

（1.河北医科大学口腔学院，河北 石家庄 050011；2.河北医科大学附属哈励逊国际和平医院 病理科，河北 衡水 053000）

目的探讨核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）1和2基因在幽门螺杆菌（Hp）相关胃癌患者中的表达变化及意义。方法采用免疫组织化学法检测胃癌患者癌组织中NOD1和NOD2蛋白的表达；采用实时聚合酶链反应（real-time PCR）检测胃癌组织中NOD1和NOD2 mRNA的表达；采用Western blot检测胃癌组织中凋亡蛋白核转录因子κB（NF-κB）和半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）表达。结果与Hp阴性胃癌患者相比，Hp阳性胃癌患者癌组织中的NOD1和NOD2蛋白表达含量和mRNA表达含量上升；Hp阳性胃癌患者中的NF-κB和Caspase-3蛋白含量升高（P＜0.05）。结论Hp阳性胃癌患者中的NOD1和NOD2呈高表达状态；且过表达NOD1和NOD2可能在Hp阳性胃癌发生、发展机制中起重要的作用。

幽门螺杆菌；胃癌；核苷酸结合寡聚化结构域；凋亡；免疫组织化学

胃癌是世界范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，且发病率与病死率逐渐上升[1-2]。胃癌的的病因及发病机制尚不明确，主要是饮食、生活习惯、环境和遗传等因素共同作用的结果[3]。研究表明，幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）感染、营养素缺乏、N-亚硝基化合物及饮酒吸烟均是胃癌发病的主要危险因素[4-5]。目前研究发现，幽门螺杆菌感染不仅取决于其菌株的多样性，而且与感染机体的遗传易感性相关[6-7]。先天免疫系统核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding oligomerzation do-main，NOD）1和2蛋白作为蛋白家族中2个重要的成员，通过识别和清除外源性病原微生物、介导天然免疫，是抵御Hp感染的第一道防线[8-9]。NOD1和NOD2的免疫调节作用可能参与Hp相关胃癌的发生、发展过程，为研究NOD1和NOD2在Hp相关胃癌发病中的作用，本研究采用免疫组织化学（SP法）及实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，realtime PCR）检测患者活检标本中NOD1和NOD2的表达，探讨NOD1和NOD2在幽门螺杆菌阳性胃癌组织中的的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 标本

选取2015年3月-2017年1月河北医科大学附属哈励逊临床医院外科收集的90例Hp阳性的胃癌患者组织学标本为实验组，均经组织病理学确诊。其中，男性49例，女性41例；年龄25～72岁，平均53岁。经快速尿素酶试验和13C尿素呼气试验均证实患者Hp阳性。同时，取30例Hp阴性胃癌患者的组织标本作为对照组。

1.2 实验材料

小鼠抗人NOD1、NOD2、肌动蛋白（β-actin）、核转录因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）及天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）单克隆抗体（均购于美国Santa Cruz公司），二抗碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG、DAB染色盒、抗体稀释液及中性树脂（均购于北京中杉金桥有限公司），real-time PCR试剂盒（购自日本TaKaRa公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学法检测NOD1和NOD2的蛋白表达水平 取120例患者的胃癌病理石蜡标本（Hp阳性90例，Hp阴性30例），分别连续切片5张（5 μm/张）。用5%血清进行室温封闭40min后，分别加入1∶1 000的NOD1和NOD2单克隆抗体孵育，4℃过夜。隔天复温后，加入二抗孵育37℃ 30min，PBS清洗后加入SP后进行恒温反应40min，加入DAB显色液进行显色，中性树胶封片后用（×10）（× 40）显微镜进行观察。阳性表达NOD1和NOD2的主要表现是棕黄色颗粒在细胞内出现。随机选择6个（×40）显微镜下的高倍视野，计算反应组织中NOD1和NOD2蛋白的表达含量的平均光密度（mean optical density，MOD）。MOD=累积光密度（IOD）与面积（area）的比值，即MOD=（IOD SUM）/area。

1.3.2Real-time PCR检测NOD1和NOD2 mRNA表达含量 采用real-time PCR对NOD1和NOD2 mRNA表达进行检测。Trizol提取胃癌组织中的总RNA，用TaKaRa公司的Prime Script RT试剂盒逆转录合成cDNA后，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行real-time PCR操作。实验采用相对定量法，采取循阈值（cycle threshold，Ct）比较法，计算不同样本之间的相对百分比。NOD1正向引物：5'-ACAAC AGGCGAACTATCTGCGTCA-3'；反向引物：5'-TCTT AACCGGAAGTAGGCGGAAG-3'。NOD2正向引物：5'-CCGTGTCCTGTTAACCTTTG-3'；反向引物：5'-AG GATCAGCAGGTACATGTC-3'。β-actin正向引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；反向引物：5'-T CCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。公式：ΔΔCt=（Ct实验组的基因-Ct实验组管家基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组管家基因）；目的mRNA的量=2-ΔΔCt。

1.3.3 蛋白质印迹法检测凋亡蛋白Caspase-3和NF-κB 取组织冰上裂解2h，离心后用BCA试剂盒进行蛋白浓度检测，将各组蛋白浓度总量调整为30 μg/μl。将各组蛋白样品加入到10%SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，转膜至PVDF膜后按1∶1000的稀释比例加入一抗和二抗。用ECL显色剂显色，用Bio-Pro凝胶成像分析仪成像以及用Quantityone软件对各泳道条带进行灰度扫描得出相应蛋白表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOD1和NOD2免疫组织化学结果

Hp阴性胃癌组织和Hp阳性胃癌组织中的NOD1蛋白免疫组织化学染色强度有差异（P＜0.05），Hp阳性胃癌组织中NOD1呈高表达水平。Hp阴性胃癌和Hp阳性胃癌组织中的NOD2蛋白免疫组织化学染色强度差异有统计学意义（P＜0.05），Hp阳性胃癌组织中NOD2呈高表达水平。见图1、2。

图1 NOD1的蛋白表达含量

图2 NOD2的蛋白表达含量

2.2 NOD1和NOD2的蛋白表达水平

免疫组织化学法检测光密度的结果，其中，Hp阳性胃癌组织中NOD1蛋白表达含量为（1.823± 0.042），Hp阴性胃癌组织中为（0.794±0.041），经t检验，差异有统计学意义（t=78.40，P=0.000），与Hp阴性胃癌组织中的蛋白表达量比较，Hp阳性胃癌组织中NOD1的蛋白表达量增加56.45%。Hp阳性胃癌组织中NOD2蛋白表达含量为（1.337±0.035），Hp阴性胃癌组织中为（0.645±0.035），经t检验，差异有统计学意义（t=62.52，P=0.000），与Hp阴性胃癌组织中的蛋白表达量比较，Hp阳性胃癌组织中NOD1的蛋白表达量增加51.76%。

2.3 NOD1和NOD2 mRNA表达含量

Hp阳性胃癌组织中NOD1 mRNA表达含量（1.511±0.062），Hp阴性胃癌组织NOD1 mRNA表达含量（1.00±0.040），经t检验，差异有统计学意义（t=38.010，P=0.000），Hp阳性胃癌组织中NOD1 mRNA表达含量升高。Hp阴性胃癌组织NOD2 mRNA表达含量（1.00±0.037），Hp阳性胃癌组织中NOD2 mRNA表达含量（1.282±0.043），经t检验，差异有统计学意义（t=31.300，P=0.000），Hp阳性胃癌组织中NOD2 mRNA表达含升高量。

2.4 NF-κB和Caspase-3蛋白含量

Hp阴性胃癌组织NF-κB蛋白表达（0.641± 0.030），Hp阳性胃癌组织中的NF-κB蛋白表达（1.083±0.061），经t检验，差异有统计学意义（t=29.330，P=0.000），Hp阳性胃癌组织中NF-κB表达升高；Hp阴性胃癌组织 Caspase-3蛋白表达（0.593±0.019），Hp阳性胃癌组织中的Hp阳性胃癌组织中的Caspase-3蛋白表达（0.857±0.037），经t检验，差异有统计学意义（t=33.000，P=0.000），Hp阳性胃癌组织中的Caspase-3蛋白表达升高。见图3。

图3 NF-kB和Caspase-3蛋白含量

3 讨论

Hp胃癌是人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]，研究表明，Hp的菌株的多样性和机体的遗传易感性均是与胃癌发病的主要危险因素[10-11]。机体抵御外来病原生物入侵的第一道防线是先天固有免疫系统。NOD1和NOD2作为在遗传上高度保守的NOD蛋白质家族成员，广泛存在于植物、动物和人体细胞内[12-13]。可通过识别细菌细胞外壁中的肽聚糖和脂多糖，依靠蛋白激酶间的相互作用，激活和活化丝裂原活化蛋白激酶及NF-κB信号通路，使外源性病原微生物细胞内的DNA破裂降解而逐渐清除[14-15]。其中，NF-κB作为一种多向转录调节作用的核蛋白因子，在炎症、氧化应激及细胞增殖等生理病理过程中发挥作用，激活后可密切参与凋亡基因的转录调控及细胞凋亡的过程，这最终导致效应性Caspase-3活化，胞核内DNA链断裂，细胞结构的全面解体细胞死亡发生[16-17]。

本研究结果显示，与Hp阴性胃癌组织相比，Hp阳性胃癌组织中NOD1和NOD2的蛋白表达含量均上升，差异明显；对NOD1和NOD2进行基因水平检测显示，与Hp阴性胃癌组织比较，Hp阳性胃癌组织中NOD1和NOD2 mRNA表达含量均升高，有明显差异。结果表明，NOD1和NOD2在抵御Hp感染及Hp相关胃癌发生过程中发挥重要的抑制作用。Hp相关胃癌组织中NF-κB信号通路过度激活，NOD1和NOD2高表达抑制Hp相关胃癌的细胞的增殖过程，同时使凋亡相关基因 Caspase-3活性升高，加速细胞凋亡的过程。结果说明NOD1和NOD2的特异性高表达可能加速细胞凋亡的过程，促进Hp相关胃癌细胞的凋亡发生。

综上所述，NOD1和NOD2在Hp相关胃癌的发生和发展过程中发挥一定的抑制作用，通过调控自身免疫系统来加速细胞凋亡的发生，但NOD1和NOD2在Hp相关胃癌中的具体作用机制还需进一步研究。在正常人群中，胃黏膜细胞中的NOD1和NOD2的异常表达可能提示幽门螺杆菌感染及Hp相关胃癌的发生，联合检测NF-κB的蛋白表达含量有助于Hp阳性胃癌的诊断，为临床治疗提供有效的帮助。

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Expression and significance of nucleotide binding oligomerization domains 1 and 2 inHelicobacter pylori-associated gastric cancer

Xue-chun Wang1,Feng-qin Zhang2
(1.School of Stomatology,Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050011,China; 2.Department of Pathology,Harrison International Peace Hospital Affiliated Hebei Medical University,Hengshui,Hebei 053000,China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of NOD1 and NOD2 in patients with Helicobacter pylori (Hp)associated gastric cancer.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expression of NOD1 and NOD2 proteins in patients withHp-associated gastric cancer.The expression of NOD1 and NOD2 mRNA was detected by real-time PCR.Western blot was used to detect the expression of NF-κB and Caspase-3.ResultsCompared with the control group (patients withHp-negative gastric cancer), the expression of NOD1 and NOD2 protein and mRNA in the patients withHp-positive gastric cancer increased significantly,the levels of NF-κB and Caspase-3 in theHp-positive gastric cancer patients were increased (P＜0.05).ConclusionsCompared with theHp-negative gastric cancer,NOD1 and NOD2 are highly expressed in the patients withHp-associated gastric cancer.And NOD1 and NOD2 over-expressions may play important roles in the development and progression ofHp-associated gastric cancer.

Helicobacter pylori;gastric cancer;NOD;apoptosis;immunohistochemistry

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.18.008

1005-8982（2017）18-0043-04

2017-03-30