近红外漫反射光谱法快速检测谷子蛋白质和淀粉含量

田 翔，刘思辰，王海岗，秦慧彬，乔治军*

近红外漫反射光谱法快速检测谷子蛋白质和淀粉含量

田 翔1,2,3，刘思辰1,2,3，王海岗1,2,3，秦慧彬1,2,3，乔治军2,3,*

（1.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，山西 太原 030031；2.农业部黄土高原作物基因与种质创制重点实验室，山西 太原 030031；3.杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031）

建立近红外漫反射光谱法测定谷子中的蛋白质和淀粉含量，提供一种快速、简便、无损的分析方法进行谷子品种资源鉴定和筛选。以191 份山西核心谷子种质为材料，采用近红外漫反射光谱法建立谷子蛋白质和淀粉含量的快速检测模型。结果表明，采用一阶导数+矢量归一化光谱预处理，分别建立谷子蛋白质和淀粉含量的校正模型，模型的校正决定系数（R2cal）分别为0.977 0和0.907 3，交叉验证均方根误差分别为0.203%和0.466%，外部验证决定系数（R2val）分别为0.989 6和0.977 2，预测均方根误差分别为0.225%和0.368%。对于谷子蛋白质和淀粉的预测，化学法和近红外仪器法测定间无显著差异，近红外测定结果是准确可靠的。说明采用近红外漫反射光谱分析技术能够满足对谷子蛋白质和淀粉含量的检测。

谷子；近红外漫反射光谱；蛋白质；淀粉

谷子起源于黄河流域，是我国古老的栽培作物，在我国北方居民生活中占有重要的地位，其淀粉、蛋白质、脂肪、维生素及硒等微量元素营养物质含量丰富，可平衡膳食促进人体健康[1]。早在《本草纲目》中有记载，谷子“治反胃热痢，消渴口感，益丹田，补虚损，开肠胃”。谷子中蛋白质含量一般为8%～12%，蛋白质含量是评价营养价值高低的重要方面，对谷子蛋白质含量的测定就成为谷子种质资源鉴定以及选育优良谷子品种和改良谷子品质的重要项目之一[2-3]。目前测定谷子中蛋白质和淀粉含量主要使用凯氏定氮法和旋光法，这些化学法可靠性高，但测定步骤繁琐、费用高，故不适宜对样品进行批量分析和无损检测[4]。在谷子品质育种过程中，需要对大量种质资源、突变体、杂交后代材料快速鉴定和筛选，且无损检测以便种子更新和繁殖。研究组利用MPA型傅里叶变换近红外光谱仪建立了谷子中蛋白质和淀粉含量的检测模型[5]，为谷子品种资源品质评价提供一种快速、简便、无损的分析方法。

近红外漫反射光谱[6]是利用有机物在近红外光谱区的特征振动吸收信息而快速测定样品中多种化学成分含量，如蛋白质、脂肪、糖类等。与常用的化学分析方法不同，近红外光谱分析法是一种间接分析技术，是用统计的方法在样品待测属性值与近红外光谱数据之间建立一个关联模型（或称校正模型），之后通过验证完成模型的建立，利用近红外光谱仪器测得的样品光谱数据即可通过软件模型预测被测组分含量，近红外法具有操作简单、分析速度快、无损伤、环保等特点。近红外漫反射光谱技术对小麦、大豆、玉米等大宗作物品质分析的报道较多，在小宗杂粮品质分析上应用很少[7]。在蔬菜的营养品质评价方面，王多加等[8]用近红外光谱法非破坏性检测了西红柿、草莓、南瓜中蔗糖、葡萄糖、果糖、柠檬酸、苹果酸等营养成分，结果都表明近红外光谱分析法可满足实际应用所需的测定精度。张帆等[9]利用近红外光谱检测西瓜干粉中纤维素和可溶性糖。本实验依据谷子蛋白质和淀粉含量的真实值建立近红外光谱分析模型，利用该模型快速定量检测谷子品质。为建立谷子常规品质近红外光谱分析模型，首先用化学测定方法测定了170 份谷子蛋白质和淀粉的含量，利用德国Bruke公司生产的MPA型傅里叶变换近红外光谱仪和OPUS建模软件，建立谷子蛋白质近红外光谱分析模型，并用21 份验证集进行预测，此法为谷子育种与品质分析提供一种方便有效的分析方法[10]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试的191 份谷子资源由山西省农业科学院农作物品种资源研究所育种专家提供，其粒形多样，产地不同，色泽分黄、白、红、绿、黑和灰色，因此该模型品质特性具有广泛的代表性。170 个样品作为建立浓度定标方程的定标样品。21 个样品做为验证集。

DHG-9140AS电热鼓风干燥箱 宁波东南仪器有限公司；8400型全自动凯氏定氮仪 丹麦福斯公司；MPA型傅里叶变换近红外光谱仪 德国Bruke公司；AP-300旋光仪 日本奥拓公司。

1.2 方法

1.2.1 谷子蛋白质含量测定

参考GB/T 5511—2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算 凯氏法》，实验室利用全自动凯氏定氮仪进行测定，每个校正样品集谷子脱壳磨碎，称取0.5 g试样2 份置于250 mL消化管，再加入消化片5 g，然后加入12 mL浓硫酸，轻轻摇动消化管，使试样被硫酸湿润。将消化管放入420 ℃的消化炉上，约90 min样品消化至透明蓝绿色液体，取出冷却至室温。把消化管放入全自动凯氏定氮仪，设定分析程序后仪器依次进行自动蒸馏、滴定、结果计算和清洗。结果为蛋白质含量（%），蛋白系数6.25。两次测定的相对误差小于1%。

1.2.2 谷子淀粉含量测定

参照GB 5006—1985《谷物籽粒粗淀粉测定法》，重复称取同一个脱壳磨粉的谷子样品两份，每份2.5 g，放在250 mL锥形瓶中，加入氯化钙-乙酸溶液高温水解25 min，迅速冷却，再加入1 mL 30%硫酸锌溶液和1 mL 15%亚铁氰化钾溶液沉淀蛋白，过滤后，在室温（20±1）℃条件下进行旋光度测定，取2 次读数平均值，计算淀粉含量，2 个平行测定结果的相对误差不得大于1.0%[11]。

1.2.3 近红外漫反射光谱采集与光谱分析

利用MPA傅里叶变换近红外光谱仪，以镀金的漫反射体作参比，样品杯为容积25 cm3的圆柱形石英杯，每次装样满2/3为宜。扫描光谱区选用3 594.9～12 790.3 cm-1，分辨率采用16 cm-1，每隔2 nm采集反射强度，重复对样品进行近红外光谱扫描采集64 次后形成一条反射光谱储存[12]。每份样品扫描2 次取平均值，并将反射光谱信息转换成吸光度储存[13]，使用OPUS建模软件对光谱进行优化处理、数学分析和回归统计。如图1所示，校正集合中170 份谷子近红外扫描图谱区域范围较宽，选择的谷子差异性明显，有利于建模。先用谷子校正样品集建立校正模型，并做内部交叉验证，再将验正样品集进行外部验证，根据交叉验证决定系数（R2cv）、交叉验证均方根误差（root mean square errors of cross-validation，RMSECV）、外部验证决定系数（R2val）、预测均方根误差（root mean square errors of prediction，RMSEP）等指标确定最优模型[14]。对于同一样品集所构建的回归方程而言，校正决定系数R2cal越大，近红外分析结果与化学分析结果越吻合，可信度越高；交叉验证决定系数R2cv越大，RMSECV越低，定标建模过程中进行交叉验证时得到的近红外预测值与化学分析值越接近，定标模型的准确度越高[15-16]。

图1 谷子近红外漫反射光谱扫描图谱Fig. 1 Near infrared spectra of foxtail millet samples

2 结果与分析

2.1 样品的化学分析结果

由表1可知，构建定标模型的谷子资源蛋白质含量范围为9.82%～16.63%，平均值为13.05%，高于玉米、接近小麦。谷子淀粉含量范围为70.13%～82.15%，平均值为76.27%。其中蛋白质含量高于谷子一级优质米鉴定标准12.5%以上的优异资源有91 份，高于16.00%的优异资源共计10 份。经对比发现种皮的颜色与蛋白含量无显著相关性，高蛋白含量的谷子普遍粒形中等偏大。谷子颜色、形态和大小各不同[17]，数据变幅较大，建立的模型有较好的适用性。通过对上述谷子种质资源的鉴定评价发现，谷子种质资源具有丰富的遗传多样性[18]。

表1 191 份山西谷子样品中蛋白及淀粉含量Table 1 Contents of crude protein and starch in 191 foxtail millet samples from Shanxi province

2.2 近红外定标模型的建立

本实验利用MPA傅里叶变换近红外光谱仪，通过OPUS/QUANT软件中的自动优化功能，分别对谷子蛋白和淀粉建模的最佳光谱预处理方法进行筛选，得到对原始近红外漫反射图谱的数学预处理方式均为一阶导数+矢量归一化法，谱区范围均选择3 594.9～12 790.3 cm-1，通过对谷子蛋白和淀粉建标模型的交叉验证，比较RMSECV和主因子数等参数，确定最优校正模型[19]。

2.3 定标模型的验证

2.3.1 内部交叉验证

根据样品的近红外的特征，利用软件的自动验证功能，软件每次在170 份建标谷子样品中随机选取2 份样品作为检验样品，用其余的谷子样品（168 份）建立定标模型，并对检验样品做预测，自动重复至所有样品均被作过检验样品[20]。谷子蛋白质和淀粉含量的交叉检验结果如图2所示，其R2cal分别为0.977 0和0.907 3，RMSECV分别为0.203%和0.466%。

图2 蛋白质含量（A）和淀粉含量（B）预测值与真实值的相关关系Fig. 2 Relationship between the predicted values and chemically measured values of crude protein (A) and starch content (B) for test set

2.3.2 外部验证

近红外模型外部验证就是采用未参加模型建立的、化学成分已知的验证集样品对所建模型的实际预测效果进行评价[21-22]。如图3所示，研究用21 份独立于建模的谷子样品对上述谷子蛋白质和淀粉模型分别检验，结果蛋白质和淀粉的R2val分别为0.989 6和0.977 2， RMSEP分别为0.225%和0.368%，斜率分别为1.010和0.913，蛋白含量预测值与真实值间绝对误差小于0.28%，淀粉含量预测值与真实值间绝对误差小于0.35%。对于谷子蛋白质和淀粉的预测，化学法和近红外仪器法测定间无显著差异，近红外漫反射光谱测定结果是准确可靠的。说明采用近红外漫反射光谱分析技术能够满足对谷子常规品质成分的检测。

图3 谷子蛋白质含量（A）和淀粉含量（B）真实值与近红外预测值线性相关关系Fig. 3 Linear correlation between actually measured values and NIRS predicted values of protein (A) and starch content (B) in foxtail millet

研究选用山西省191 份谷子种质资源，利用MPA傅里叶变换近红外光谱仪，通过近红外分析技术，借助于近红外定标软件，分析谱区为3 594.9～12 790.3 cm-1，采用一阶导数+矢量归一化光谱预处理[23-24]，初步建立谷子蛋白质和淀粉含量的预测模型。谷子蛋白和淀粉定标模型外部检验决定系数达0.97以上、误差在0.368%以下，在谷子资源品质育种中能够满足大批量品种的快速、无损检测要求，有效地提高谷子品质育种效率，为谷子蛋白和淀粉含量分析鉴定提供了一种新的、有效的技术手段。通过对上述谷子蛋白质和淀粉含量评价鉴定，筛选出高蛋白和高淀粉含量的优异资源30 份，今后可利用初步建立的谷子品质预测模型快速检测更多的谷子资源，为育种和生产服务[25-27]。

3 讨 论

采用MPA傅里叶变换近红外光谱仪对191 份谷子种子样本进行光谱扫描，利用光谱定量分析软件进行光谱预处理、数学方法运算及回归统计分析，得到了谷子蛋白质和淀粉的近红外定标模型。由于建标的谷子样本是完整带壳的，也不会因脱壳造成水分或营养流失，而且经扫描后谷子籽粒不会破损，因此该模型既满足了谷子品质育种中的资源的快速检测要求，也是一种无损检测的方法。不仅为谷子品质育种及资源评价提供有益的参考，而且对加快谷子品种资源研究，提供了十分方便的测试手段[28]。

本实验使用定标样品较少，对我国的复杂多样、品种繁多的谷子种质来说，不具备普遍代表性，另外谷子外壳的颜色、化学真值的准确度和谷子的纯度、谷子建标资源数量都是影响模型的准确度的重要因素。今后工作中需不断补充新的谷子进行模型补充矫正和升级优化，进一步保持模型的稳定性和提高模型的准确性。

今后可利用傅里叶变换近红外漫反射技术测定物质成分具有无损、快速、准确的特点，探索其在谷子品质测定方面的广泛的应用，如纤维素、脂肪、氨基酸等化学成分的定量研究[29-30]。

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Application of Near Infrared Diffuse Reflectance Spectroscopy in Rapid Detection of Crude Protein and Starch in Foxtail Millet

TIAN Xiang1,2,3, LIU Sichen1,2,3, WANG Haigang1,2,3, QIN Huibin1,2,3, QIAO Zhijun2,3,*
(1. Institute of Crop Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China; 2. Key Laboratory of Crop Gene Resources & Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture, Taiyuan 030031, China; 3. Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031, China)

This study aimed to establish a near infrared (NIR) diffuse reflectance spectrometry method for measuring the contents of crude protein and starch in foxtail millet for providing a fast, simple and non-destructive analytical method for the identification and screening of foxtail millet germplasm resources. For this purpose, a total of 191 samples of a foxtail millet core collection in Shanxi province were measured using NIR diffuse reflectance spectroscopy. The results showed that with the spectral preprocessing method of first derivative + vector normalization, calibration models were established to predict the contents of crude protein and starch in foxtail millet. The corresponding coefficients of determination for calibration (R2cal) were 0.977 0 and 0.907 3, and the root mean square errors of cross-validation (RMSECV) were 0.203% and 0.466%, the coefficients of determination for external validation (R2val) were 0.989 6 and 0.977 2, and the root mean square errors of prediction (RMSEP) were 0.225% and 0.368%, respectively. For the detection of crude protein and starch foxtail millet, no significant differences were seen between chemical analysis and NIR measurement, but the results obtained with NIR measurement were more accurate and reliable. NIR diffuse reflectance spectrometry technology can be useful for the detection of crude protein and starch in foxtail millet.

foxtail millet; near infrared (NIR) diffuse reflectance spectrometry; crude protein; starch

10.7506/spkx1002-6630-201716022

S515

A

1002-6630（2017）16-0140-05

2016-06-22

国家谷子高粱产业技术体系谷子糜子生理岗位项目（CARS-06-13.5-A16）；国家农作物种质资源平台山西作物子平台项目（NICGR2016-02）；山西省农作物种质资源鉴定评价研究项目（2017ZZCX-17）；山西省省级财政支农专项（2016ZYZX41）

田翔（1982—），女，助理研究员，硕士，研究方向为农作物品质分析。E-mail：704193015@qq.com

*通信作者：乔治军（1964—），男，研究员，学士，研究方向为糜子栽培和资源。E-mail：nkypzs@126.com.cn

田翔, 刘思辰, 王海岗, 等. 近红外漫反射光谱法快速检测谷子蛋白质和淀粉含量[J]. 食品科学, 2017, 38(16): 140-144. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716022. http://www.spkx.net.cn

TIAN Xiang, LIU Sichen, WANG Haigang, et al. Application of near infrared diffuse reflectance spectroscopy in rapid detection of crude protein and starch in foxtail millet[J]. Food Science, 2017, 38(16): 140-144. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716022. http://www.spkx.net.cn