食管酸灌注对哮喘小鼠气道炎症及BRP-39浓度的影响

贾丽萍 蔡梓滔 陈祖光 刘美丹 姚卫民

食管酸灌注对哮喘小鼠气道炎症及BRP-39浓度的影响

贾丽萍1蔡梓滔2陈祖光2刘美丹2姚卫民2

目的 观察食管酸灌注对哮喘小鼠气道炎症的影响及BRP-39浓度与哮喘小鼠气道炎症的关系。方法 60只雄性BALB/c小鼠随机分成6组(正常组、灌盐组、灌酸组、哮喘组、哮喘灌盐组、哮喘灌酸组)，用OVA致敏和激发的方法建立哮喘模型，用食管下段盐酸灌注建立胃食管反流(gastroesophageal reflux，GER)模型，末次抗原激发后24小时处死小鼠，ELISA法检测回收的BALF及血清中的BRP-39；BALF细胞沉渣涂片后染色计数细胞总数及分类计数。 结果 (1)单纯哮喘组及哮喘灌盐、哮喘灌酸组小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞的细胞分类数均较对照组高，以嗜酸性粒细胞增高最为明显，具有统计学意义(P<0.05)；灌酸组小鼠BALF中细胞总数及中性粒细胞、淋巴细胞的细胞分类数均较对照组高，以中性粒细胞增高最为明显，具有统计学差异(P<0.05);正常组与灌盐组小鼠，哮喘灌盐组与哮喘灌酸组小鼠无统计学差异。(2)与对照组比较，除灌盐组外，其余各组特别是哮喘灌酸组，BALF及血清中BRP-39的浓度均明显升高，且与BALF中的细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞呈正相关(P<0.05～P<0.01) 结论 多次食管酸灌注可引起气道内炎症反应，伴有血清及BALF中的BRP-39浓度明显升高，可能与GER诱发或加重哮喘有关。

小鼠；哮喘；胃食管反流；BRP-39

近20年来支气管哮喘发病率持续增高，控制欠佳，哮喘仍然是全球主要的公共卫生问题之一。Osler[1]首次提出GER与哮喘的相关性，近年越来越多的证据表明GER在难控性哮喘中有较高的患病率，被认为是哮喘控制欠佳原因之一，可能是哮喘发生发展的独立危险因素[2]。GER引起哮喘发生发展的机制并不明确，反射学说认为食管受酸刺激后，经食管-支气管反射，引起肺内神经源性炎症反应，因此研究NKA、NKB、SP、CGRP等相关神经肽的研究较多[3]，而探讨其他炎症反应途径的研究较少。本实验通过建立胃食管反流及哮喘小鼠模型，观察GER对哮喘小鼠肺部炎症的影响及BRP-39在不同造模组小鼠血清及BALF中的浓度变化情况，探讨BRP-39在GER促进哮喘发生发展中的可能作用。

资料与方法

一、材料

鸡卵白蛋白(OVA，Grade V)(美国Sigma公司)；氢氧化铝[AI(OH)3]凝胶(美国Sigma公司)；猪胃蛋白酶(美国Sigma公司)；胰酶(美国JRH公司)；HCl(广州化学试剂公司)；YKL-40 试剂盒(广州拓科达生物科技有限公司)；自制雾化箱(20cm×30cm×30cm，树脂箱);百瑞超声雾化器(德国百瑞公司)；12号小鼠灌胃针；

二、动物分组及造模方法

1 动物分组：60只清洁级，雄性，BALB/c小鼠，8-9周龄，体重18-20g，购自广东省实验动物中心，随机分成6组，每组10只。A组(正常对照组)：未予任何处理；B组(灌盐组)：生理盐水灌注食管；C组(灌酸组)：稀盐酸灌注食管；D组(哮喘组)：鸡卵白蛋白OVA致敏和激发；E组(哮喘并灌盐组)：哮喘造模同时，致敏第一天开始食管灌注生理盐水(灌注方法同B组)；F组(哮喘并灌酸组)：哮喘造模同时，致敏第一天开始食管灌注稀盐酸(灌注方法同C组)。

2 造模方法

(1) 建立哮喘小鼠模型及给药：参照文献[4-5]并加以改进，方法如下：① 致敏：哮喘小鼠，于第0天、第7天、第14天予腹腔注射20μg OVA(20mg Al(OH)3+200μL NS)致敏液0.2mL。② 抗原激发：哮喘小鼠，于实验流程的19天，配制含1%OVA的生理盐水雾化溶液，现配现用。将哮喘组、哮喘灌盐组及哮喘灌酸组小鼠分批置于自制雾化箱(30cm×20cm×15cm)中，每批用10mL的雾化液，每天一次，每次雾化约40分钟，共雾化3天，以出现抓耳挠腮、点头呼吸、腹肌收缩、匍匐不起等症状时代表诱喘成功。

(2) 建立胃食管反流小鼠模型及给药：参照文献[6]并加以改进，方法如下：单手固定小鼠，经口将12号灌胃针插入小鼠食管中下段，缓慢注入0.1N HCl(含0.5%胃蛋白酶)0.3mL,2次/天，共21天。灌注完毕，小鼠无呕吐、抽搐等不适。灌盐组予同等剂量生理盐水代替，其时间和方式同灌酸组小鼠相同。

三、标本的制备及检测

一次抗原激发后48小时，小鼠摘眼球取血，缺血死亡。

1 外周血的收集：摘取眼球取血，收集于EP管中，立即放置4 ℃冰箱中。4小时后，以3000rpm离心10min(4 ℃)，取上清液分装入EP管中，存放入-80 ℃冰箱。离心液用ELISA法测试BRP-39的浓度。

2 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集：将小鼠固定在手术台上，打开胸腔，分离气管，结扎右主支气管，于气管软骨环3-4处，插入经改良的留置针，于气管插管处分批缓慢注入共0.8mL的生理盐水灌洗左肺，留置30秒，再缓慢回抽，共3次，记录回收的肺泡灌洗液(BALF)，计算回收率，保证回收率80%以上。以3000rpm离心10min(4 ℃)后细胞沉渣用于细胞分类计数，上清液分装入EP管中，-80 ℃保存。离心液用ELISA法测试BRP-39的浓度。

四、统计方法

结 果

一、BALF细胞总数及分类计数

哮喘造模组小鼠(包括单纯哮喘组及哮喘灌盐、哮喘灌酸组)BALF中细胞总数较正常对照组高，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的细胞分类百分比均较对照组高，以嗜酸性粒细胞增高最为明显，具有统计学的意义(P<0.05-P<0.01)；灌酸组小鼠BALF中细胞总数较对照组高，中性粒细胞和淋巴细胞的细胞分类数均较对照组高，但以中性粒细胞增高最为明显，具有统计学差异(P<0.05-P<0.01)，嗜酸性粒细胞与对照组比较无明显变化。(见表1)。

表1 6组小鼠BALF中的细胞绝对计数及分类的比较±s)

注：(M%、L%、N%、E%分别代表巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞比例)；与正常对照组相比，*P<0.05；***P<0.001

二、BRP-39浓度变化

各组BALF中的BRP-39浓度比血清中的BRP-39浓度高，以哮喘灌酸组最为明显；与对照组比较，除灌盐组外，其余各组BALF液、血清中BRP-39浓度均明显升高，且哮喘组较单纯灌酸组升高的幅度大，哮喘灌酸组升高尤其明显；正常组vs灌盐组，哮喘灌盐组vs哮喘灌酸组无统计学差异，说明食管灌盐不影响小鼠肺部炎症反应。(见表2)。

表2 6组小鼠BALF液、外周血中BRP-39浓度比较

注：与对照组比较：*P<0.05；与灌酸组比较：▲P<0.05

三、相关性分析

实验各组BALF BRP-39、血BRP-39与BALF中的细胞总数呈正相关(P<0.05-P<0.01)；BALF BRP-39、血BRP-39与中性粒细胞、嗜酸性粒细胞比例之间亦正相关，余无明显相关性(见表3)。

表3 各组BALF及血BRP-39浓度与BALF中的细胞绝对计数及分类之间的相关性

注：*P<0.05，**P<0.01

讨 论

YKL-40是壳质酶家族的一类分泌蛋白，存在于哺乳动物中，在人的同系物则称为YKL-40，在小鼠称为BRP-39。YKL-40在炎症细胞和多种恶性肿瘤细胞中高度分泌和表达[10]，目前认为与细胞的增殖、分化、凋亡、转移、组织重建和炎症发生密切相关，但它真正的生理学及生物学功能还不清楚[11]。越来越多的研究显示YKL-40参与多种呼吸系统疾病的发病机制。Nordenbaek等[12]发现肺炎患者或菌血症患者血清中YKL-40浓度比健康人要高，YKL-40参与了中性粒细胞对病原微生物的吞噬作用，认为其广泛地参与了人体组织的炎性反应。Matsuura[13]等在小鼠实验中发现BRP-39可以促进巨噬细胞释放IL-8、MCP-1、MMP-9，显示其在慢阻肺慢性气道炎症和结构重塑中其重要作用。Lee[14]等多个研究证实了YKL-40参与了哮喘和其他过敏性疾病过敏性反应的多个阶段。在抗原致敏、IgE诱导及刺激树突状细胞募集和活化已经诱导交替性巨噬细胞的激活中均起到重要的作用。可刺激树突状细胞募集和活化、增加细胞数量，减少T细胞凋亡、延长其存活时间、增加TH2数量、增强TH2分化等方面[15]。Tang等[16]研究发现，哮喘患者YKL-40的血浆水平较对照组明显升高，且与总IgE水平及外周血嗜酸粒细胞百分比呈正相关。Chupp等[17]首次明确阐明哮喘群体肺YKL-40和气道重塑(上皮下基底膜厚度增加)相关。这些研究结果均表明YKL-40参与了多种气道慢性炎症性疾病，特别是与过敏性哮喘的发病密切相关，但YKL-40是否与GER加重哮喘炎症反应相关，尚未见有相关报道。通过测试不同造模组血清及BALF液中BRP-39的浓度，以了解BRP-39与食管酸灌注引起小鼠肺部炎症反应及加重哮喘相关性。

本实验研究结果中，BALF比血清中BRP-39的浓度升高更加明显，这是因为BALF中的细胞及炎症因子浓度比血清更能客观且直接地反映气道的炎症状况。与对照组比，除灌盐组外，其余各组特别是哮喘灌酸组，BALF及血清中BRP-39的浓度均明显升高，且与BALF中的细胞总数及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞呈正相关，因此BRP-39浓度变化能在一定程度上反映气道炎症程度，与多次食管酸灌注加重哮喘小鼠气道内的炎症反应相一致。

已有研究证明BRP-39不仅在过敏性炎症疾病中促进嗜酸粒细胞的聚焦[17]，也参与了中性粒细胞吞噬病原菌的过程[12-13]，故BRP-39在多次食管酸灌注进一步加重哮喘小鼠气道炎症的发病过程中机制中可能发挥着重要作用，为探究哮喘的发病机制提供一些不同的研究方向。BRP-39并不是炎症介质或细胞因子，只是炎症程度的生物标志物，并不能直接导致炎症，这需要进一步弄清BRP-39在炎症反应中的机制。

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Effect of esophageal acid infusion on airway inflammation and changes of BRP-39 levels in asthmatic mice model

JIALi-ping,CAIZhi-tao,CHENZu-guang,LIUMei-dan,YAOWei-ming.

TheCentralHospitalofHuanggangCity,Huanggang,Hubei438000,China

Objective To observe the influence of airway inflammation by repeating esophageal acid infusion and the relationship between BRP-39 levels and airway inflammation in mice with asthma. Methods A total of 60 male BALB/c mice were randomly divided into six groups (the control group, the salt group, the HCl group, the asthma group, the asthma and salt group, the asthma and HCl group). Asthma model was established by intraperitoneal injection and atomization chicken ovalbumin (OVA). HCL was used to do lower esophageal perfusion to establish GER model. Mice were sacrificed in 24 hours after the last antigen stimulation. The BRP-39 levels in serum and BALF of the mice were measured by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). The total and classification cell numbers in BALF were recorded. Results (1) The total cells, eosinophils, neutrophils and lymphocytes of BALF in the asthma model group (including the asthma group, the asthma and NS group, and the asthma and HCL group) were higher than those in the control group, especially for eosinophils (P<0.05-P<0.01). Compared with the control group, the total cells, neutrophils and lymphocytes in BALF of the HCL group were higher, especially for neutrophils (P<0.05-P<0.01). There was no statistically difference in Eosinophilic cells between the HCL group and the control group. (2) Compared with the normal group, in addition to the salt group, BRP-39 concentrations in BALF fluid and blood increased in the other groups (P<0.05), especially in the asthma and HCL group. And there was a positive correlation between BRP-39 levels and the number of BALF, neutrophils, eosinophils (P<0.05-P<0.01). Conclusion Repeated?esophageal acid?perfusion?can cause?inflammation in lung, and BRP-39 levels in serum and BALF increase. GER can cause or aggravate asthma, which may be associated with BRP-39 levels.

mice; asthma; gastroesophageal reflux; BRP-39

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.09.010

广东医学院博士启动项目(No.XB0816)；广东医学院附属医院博士启动项目(No.10301B010012)

1. 438000 湖北 黄冈，黄冈市中心医院呼吸内科 2. 524001 广东 湛江，广东医科大学附属医院呼吸内科

姚卫民，E-mail:490296443@qq.com

2016-12-12]