香菇多糖对肿瘤坏死因子-α诱导炎症细胞模型的作用

刘健雄，徐嘉辉，陈德明，潘嘉问

(1.鹤山市人民医院普通外科，广东鹤山529700；2.广东省中医药工程研究院，广东广州510095；3.鹤山市人民医院肿瘤内科，广东鹤山529700)

香菇多糖对肿瘤坏死因子-α诱导炎症细胞模型的作用

刘健雄1，徐嘉辉2，陈德明1，潘嘉问3

(1.鹤山市人民医院普通外科，广东鹤山529700；2.广东省中医药工程研究院，广东广州510095；3.鹤山市人民医院肿瘤内科，广东鹤山529700)

目的研究香菇多糖对TNF-α诱导炎症细胞模型的作用。方法选取小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究载体，实验分为空白组、模型组、香菇多糖高、中和低浓度组，共5组，每组设5个复孔。采用1 g/L、10 g/L、100 g/LTNF-α诱导建立炎症细胞模型，予香菇多糖进行给药孵育，于37℃及5%CO2的条件下培养6 h，取上清样品备测IL-6、IL-18与IL-23。采用酶联免疫法检测IL-6、IL-18与IL-23含量水平。结果采用10 g/L TNF-α诱导成功建立炎症细胞模型。药物孵育后，5组的IL-6、IL-18及IL-23水平比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，香菇多糖高、中、低浓度组和模型组的IL-6[(38.85±4.49)pg/mL、(56.53±7.41)pg/mL、(82.16±5.48)pg/mL vs(97.50±12.04)pg/mL]、IL-18 [(28.26±4.54)pg/mL、(43.71±5.29)pg/mL、(52.62±6.55)pg/mL vs(80.27±6.90)pg/mL]及IL-23[(60.63±4.02)pg/mL、(74.91±7.64)pg/mL、(90.51±8.73)pg/mL vs(121.31±9.97)pg/mL]水平比较，香菇多糖高、中、低浓度组明显低于模型组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。香菇多糖高浓度组的IL-18水平与空白组相当[(28.26±4.54)pg/mL vs(17.76± 1.22)pg/mL]，差异无统计学意义(P＞0.05)。结论香菇多糖能够抑制TNF-α诱导炎症细胞模型的IL-6、IL-18和IL-23，故而具有免疫调节作用，且高浓度香菇多糖能够显著减少IL-18的分泌。

肿瘤坏死因子-α；香菇多糖；胃癌；辅助化疗

胃癌是临床常见的恶性肿瘤之一，流行病学研究表明，胃癌高发年龄为50～60岁[1]。随着老年化问题的日渐严重，我国已经成为胃癌的高发国家之一，严重制约人们的生存质量与临床结局，给家庭及社会带来沉重负担。手术治疗是目前临床诊治胃癌行之有效的干预手段，但术后恢复与避免再发是临床的重点与难点[2]。研究表明，术后辅助化疗有利于提高患者的生存率，但化疗药物的毒副反应相对亦会制约患者的生存质量，因而寻找减少术后化疗不良反应及改善机体功能成为了目前的急切需求[3]。香菇多糖是生物反应调节剂，能用于术后化疗的辅助治疗[4]。本文通过研究香菇多糖对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α诱导RAW264.7细胞炎症模型的作用，探讨其对改善机体抗炎免疫功能的作用机制，为胃癌术后化疗恢复提供基础研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料DMEM高糖细胞培养基，由美国Cellgro公司提供；澳洲胎牛血清，由美国Gibco公司提供；TNF-α标准品，由罗氏公司提供；白介素(interleukin，IL)-6、IL-18和IL-23酶联免疫试剂盒，由杭州联科生物有限公司提供；香菇多糖注射液，由金陵药业股份有限公司福州梅峰制药厂生产，国药准字Z10920012。小鼠RAW 264.7巨噬细胞，由中国科学院细胞库提供。

1.2 实验仪器全波长多功能酶标仪由美国Thermo公司生产；高速离心机由德国Eppendorf公司生产；光学显微镜由日本Olympus公司生产；CO2培养箱由日本Sanyo公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养RAW 264.7细胞的传代：以含有体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM细胞培养基进行培养，于37℃，5%CO2条件使用培养瓶培养。采用一次性细胞刮刀进行脱壁及传代，每天换液1次，2 d传代1次，传至10代稳定后取对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 分组接种以每孔1×104个细胞接种至96孔板，于37℃，5%CO2的条件下培养12 h。选择贴壁及生长良好的细胞板进行试验，标记并分为空白组、模型组、低浓度组、中浓度组及高浓度组，每孔设5个孔，边缘采用PBS封板。

1.3.3 建立模型参考文献方法，采用TNF-α诱导RAW267.4细胞建立炎症细胞模型：以37℃磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次；于模型组及香菇多糖高、中、低浓度组孔中加入浓度调至TNF-α 1 g/L、10 g/L、100 g/L的细胞培养基，在空白组孔中加入等量培养基，适应性培养30 min，观察贴壁情况。

1.3.4 给药孵育建模后，以终浓度为100 μg/L、200 μg/L、300 μg/L的香菇多糖注射液进行加药孵育，以等量37℃PBS加入空白组与模型组；轻轻震荡数下，于37℃，5%CO2的条件下培养6 h，取上清样品备测IL-6、IL-18和IL-23。

1.3.5 检测样本采用酶联免疫法对备测样本进行IL-6、IL-18和IL-23含量水平的检测，按照说明书方法检测波长选择450 nm与570 nm，OD值使用标准曲线进行换算，其中，OD=OD450nm-OD570nm。

1.4 统计学方法应用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，多组间比较采用One-way ANOVA分析，组间两两比较采用Bonferroni分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度TNF-α诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立情况采用TNF-α浓度为1 g/L、10 g/L、100 g/L的细胞培养基培养30 min进行建模，10 g/L浓度水平的RAW264.7细胞出现变形，100 g/L浓度水平的RAW264.7细胞出现严重变形，甚至脱壁漂浮现象，而1 g/L浓度水平的RAW264.7细胞没有出现明显变形坏死表现，见图1。因此，采用10 g/L的浓度水平TNF-α诱导建立炎症细胞模型进行给药孵育实验。

2.2 不同浓度香菇多糖对TNF-α诱导RAW264.7细胞炎症模型的IL-6、IL-18和IL-23水平的影响药物孵育后，各组的IL-6、IL-18及IL-23水平比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。其中，香菇多糖高、中、低浓度组IL-6、IL-18及IL-23水平均明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。但是，在IL-18含量方面，香菇多糖高浓度组与空白组相当，差异无统计学意义(95%CI=-0.08～21.08，P＞0.05)，提示该药高浓度组能够显著降低IL-18水平，见表1。

图1 不同浓度TNF-α作用下诱导RAW264.7细胞的生长情况

表1 不同浓度香菇多糖对TNF-α诱导RAW264.7细胞炎症模型的IL-6、IL-18和IL-23的含量水平影响

表1 不同浓度香菇多糖对TNF-α诱导RAW264.7细胞炎症模型的IL-6、IL-18和IL-23的含量水平影响

注：与模型组比较，aP＜0.05；与空白组比较，bP＞0.05。

38.20±3.50 121.31±9.97 60.63±4.02a74.91±7.64a90.51±8.73a93.50 0.00空白组模型组高浓度组中浓度组低浓度组F值P值5 5 5 5 5 0.00 10.00 10.00 10.00 10.00 21.43±4.85 97.50±12.04 38.85±4.49a56.53±7.41a82.16±5.48a87.73 0.00 17.76±1.22 80.27±6.90 28.26±4.54ab43.71±5.29a52.62±6.55a103.29 0.00

3 讨论

胃癌术后患者机体免疫功能低下，加之化疗药物的不良作用，加重了患者机体复合，从而影响机体恢复与生存质量。临床研究发现，香菇多糖能够显著改善胃癌根治术后化疗患者外周T细胞亚群，通过激活CD4+细胞，从而提高机体抗炎免疫功能，但具体作用机制尚未明确阐明[5]。系统评价表明，TNF-α的多态性与胃癌发病相关，是我国胃癌危险人群发病的重要因素之一[6]。同时，术后患者组织学的改变以及化疗药物自身对机体的作用均不同程度导致机体炎症反应的发生发展，常见低热、疼痛等临床症状，因而影响机体恢复。小鼠RAW264.7细胞是良好细胞实验载体，被广泛运用于体外炎症机制研究[7]。已有研究表明，TNF-α能够诱导RAW264.7细胞建立炎症细胞模型[8]。本研究结果表明，以10 g/L浓度水平的TNF-α诱导建立炎症细胞模型最为符合体外实验要求。

既往临床研究表明，香菇多糖能够提高中晚期胃癌FOLFOX4化疗方案的疗效，提高患者的耐受性与减少不良反应的发生，其能明显改善Th2细胞中IL-10的过度表达，从而抑制T细胞克隆增殖以控制肿瘤的进展[9]。本研究结果则表明，香菇多糖能够显著减少炎症细胞模型IL-6、IL-18和IL-23的分泌，高浓度组IL-18水平与空白组正常水平相当。IL-18是多功能促炎因子，不仅能够促进Th1细胞和自杀细胞表达Fas配体介导细胞毒性，还能够增强Th2细胞因子的分泌[10]，故香菇多糖在临床实际中的抗炎免疫调节效果可能与调节IL-18的分泌相关。此外，Th17细胞在胃癌及术后也起到重要免疫调节作用。已有研究认为，IL-23可能通过PI3K/Akt信号通路促进胃癌细胞的迁移，因而IL-23在胃癌患者组织中出现高表达[11]。而本研究结果则表明，香菇多糖能够抑制TNF-α诱导的炎症细胞模型的IL-23分泌。

综上所述，香菇多糖能够抑制TNF-α诱导炎症细胞模型的IL-6、IL-18和IL-23，对Th2和Th17细胞具有免疫调节作用，且高浓度香菇多糖能够显著减少IL-18的分泌。

[1]Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer,2010,127(12): 2893-2917．

[2]Malfertheiner P,Megraud F,O′Morain CA,et al.Management of Helicobacter pylori infection—the Maastricht IV/Florence Consensus Report[J].Gut,2012,61(5):646-664.

[3]Bilici A,Selcukbiricik F,Demir N,et al.Modified docetaxel and cisplatin in combination with capecitabine(DCX)as a first-line treatment in HER2-negative advanced gastric cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(20):8661-8666.

[4]马云飞,孙旭,念家云,等.香菇多糖联合化疗治疗晚期胃癌的Meta分析[J].辽宁中医杂志,2016,43(11):2260-2265.

[5]杜秀坤,聂会生,梁瑜,等.胃癌根治术后化疗对患者外周血T细胞亚群及NK细胞的影响[J].河北医药,2010,32(1):49-50.

[6]夏磊洲,刘毅,郭森,等.肿瘤坏死因子α多态性与中国人群胃癌相关性的Meta分析[J].中国现代普通外科进展,2013,16(9): 703-707.

[7]白生宾,钟近洁,陈红香,等.RAW264.7细胞诱导分化和鉴定[J].科技导报,2010,28(1):44-47.

[8]Huang S,He P,Peng X,et al.Pristimerin inhibits prostate cancer bone metastasis by targeting PC-3 stem cell characteristics and VEGF-induced vasculogenesis of BM-EPCs[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(1):253-268.

[9]林百顺,戴勇.香菇多糖联合FOLFOX4化疗方案治疗对中晚期胃癌患者血清VEGF、IL-10和生活质量的影响[J].世界华人消化杂志,2015,23(33):5372-5376.

[10]陈小红,王化修.Caspase-1和IL-18在胃癌组织中的表达及临床意义[J].实用癌症杂志,2008,23(2):132-134.

[11]李清靖,单保恩,李宏,等.胃癌患者Th17/Treg细胞失衡的研究[J].中国全科医学,2015,18(29):3596-3600.

Effect of lentinan in treating the cell model of inflammatory response induced by tumor necrosis factor-α.

LIU Jian-xiong1,XU Jia-hui2,CHEN De-ming1,PANG Jia-wen3.1.Department of General Surgery,Heshan People's Hospital,Heshan 529700,Guangdong,CHINA;2.Guangdong Engineering Institute of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA;3.Department of Oncology,Heshan People's Hospital,Heshan 529700, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of lentinan in treating the cell model of inflammatory response induced by tumor necrosis factor(TNF)-α.MethodsRAW 264.7 cell was used as the study model,and there were 5 groups including the blank group,model group,high,medium and low concentrations of lentinan group.The inflammatory cell models induced by TNF-α(1 g/L,10 g/L,100 g/L).Then under the situation of 37℃and 5%CO2,test groups were added lentinan to have the incubation with 6 h,and the supernatant was collected.The concentrations of interleukin (IL)-6,IL-18 and IL-23 were tested by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsIt is successful to use 10 g/L TNF-α to induce the inflammatory cell model.After the incubation,there were difference between five groups inthe concentrations of IL-6,IL-18 and IL-23(P＜0.05).Moreover,the concentrations of IL-6 of(38.85±4.49)pg/mL, (56.53±7.41)pg/mL,(82.16±5.48)pg/mL,respectively,IL-18 of(28.26±4.54)pg/mL,(43.71±5.29)pg/mL,(52.62± 6.55)pg/mL,respectively and IL-23 of(60.63±4.02)pg/mL,(74.91±7.64)pg/mL,(90.51±8.73)pg/mL,respectively in high,medium and low concentrations of lentinan group were obviously lower than(97.50±12.04)pg/mL,(80.27±6.90) pg/mL,(121.31±9.97)pg/mL in the model group(P＜0.05).However,there was no significant difference between the high concentration of lentinan group and blank one in the aspect of IL-18,(28.26±4.54)pg/mL vs(17.76±1.22)pg/mL (P＞0.05).ConclusionLentinan can inhibit the secretion of IL-6,IL-18,and IL-23 in the cell model of inflammatory response induced by TNF-α,so it has immunomodulatory effect and the high concentration of lentinan could obviously decrease the section of IL-18.

Tumor necrosis factor-α(TNF-α);Lentinan;Gastric cancer;Adjuvant chemotherapy

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.004

R735.2

A

1003—6350（2017）15—2423—03

2017-05-07)

广东省江门市卫生局医学科研基金(编号：A2012738)

刘健雄。E-mail：13695812@qq.com